广西烟仓主要霉变生物的生物学特性研究（图）
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随着广西卷烟工业的迅速发展，烟叶贮藏的规模越来越大，贮藏时间也相应延长。然而，长期以来，由于仓贮条件简陋，设施落后，管理粗放，加上广西地处亚热带，高温多雨湿度大，致使烟叶在贮藏期间常常遭受各种霉变生物的危害，造成巨大经济损失。据2001-2002年普查的结果，已分离鉴定出危害广西贮藏烟叶的有曲霉（（Aspergillus）、青霉（Penicillium）、根霉（Rhizopus）、毛霉（Muor）等四个属的霉变生物，其中以曲霉菌的分布最广，危害最重。
目前，我国各省对烟叶仓贮病虫害的研究仅在虫害方面有较多的报道，而霉变生物研究的报道则很少，只有云南省的王革等就云南发现的泡盛曲霉（A.awawori）等8种曲霉的形态特征、培养性状和河南的姜夫等及江苏的谢宗传等对卷烟防霉技术作过相关报道。
2001年，在广西区烟草公司的大力支持下，作者围绕广西烟仓霉变生物的种类鉴定、主要有害生物的生物学特性、霉变发生条件及防治技术展开了大量的调查和研究。本文就主要有害生物生物学特性的测定结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
选择2001-2002年广西烟仓霉变生物种类普查中出现频率较高的三种曲霉作供试菌，即溜曲霉（As-pergillustamariiKita，采自钟山县）、匍匐散囊菌原变种（Eurotium repens de Bary，为叙述方便，以下简称匍匐散囊菌，采自南宁市）、谢瓦散囊菌（Eurotium chevalieri Man-gin，采自南宁市）。各分离菌均先经单孢纯化并回接验证其致病性后移入PDA斜面上保存，试验前再移入PDA平板上25℃培养7d后供测定用。
1.2 培养基的制备
马铃薯（PDA）、肉汁胨（NA）、查氏（CA）等组合培养基按常规方法制作，半组合烟汁培养基是按每1000ml水加入所需烟叶（贮藏期烟叶）的百分含量煮沸30min，用纱布过滤，加水补足1000ml后，加入琼脂18g，121℃下湿热消毒20min制成；
天然烟叶培养基是按每三角瓶（300m1）装入贮藏烟叶（片烟）5g，再加入水20ml，121℃下湿热消毒20min制成。
1.3 温度对其生长的影晌
将直径5mm的菌苔移入PDA平板上，每皿一块，置于中央，分别在13℃、16℃、19℃、22℃、25℃、28℃、31℃、34℃、37℃、40℃、43℃、46℃和49℃ 13种温度下培养，分别于7d（溜曲霉）和7d，14d（匍匐散囊菌和谢瓦散囊菌）后测量菌落直径，计算其净生长量[（菌落直径—5mm）/21并作比较。每处理3皿，即3次重复（下同）。
1.4 湿度对其生长的影晌
先将贮藏的烟叶剪成直径约为85mm的圆片，并经湿热灭菌备用。试验在密闭容器（25×25×11cm3保鲜盒）中进行，以氯化钙等无机盐饱和溶液作湿度控制物（每盒200ml，测定仪为天津市气象海洋仪器厂生产的WHM5型温湿度表），试验设51%（氯化钙）、65%（碳酸钾）、70%（亚硝酸钠）、75%（氯酸钠）、82%（硫酸铵）、90%（硫酸锌）和94%（硫酸钙）7种湿度。测定时先将烟叶平放于培养皿内，然后移入直径5mm的菌苔，每皿1块，置于25℃下培养，分别于5d，10d，15d，20d，25d，45d后观察各菌的生长情况。
1.5 pH值对其生长的影晌
将直径5mm的菌苔移入pH值分别为2.5，3.0，3.5，4.0，45，5.0，55，6.0，6.5，7.0，75，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0，10.5，11.0和11.5的PDA培养基上，置25℃下恒温培养，分别于7d和10d后（溜曲霉）或7d，14d和21d后（谢瓦散囊菌和匍匐散囊菌）测量菌落直径，计算其净生长量并作比较。
1.6 不同培养基对其生长的影晌
将直径5mm的菌苔分别移入10%烟叶煎汁、5%烟叶煎汁、NA，PDA和CA等5种不同的培养基上，置25℃下恒温培养，分别于7d和10d后（溜曲霉）或7d，14d和21d后（谢瓦散囊菌、匍匐散囊菌）测量菌落直径，计算其净生长量并作比较。在天然烟叶培养基上的培养是将菌苔接种至三角瓶内烟叶表面的中央，每瓶一块，在同样温度下培养7d后观察菌体生长情况。
1.7 致死温度和时间的测定
将各菌的孢子连同菌丝用含1%吐温20的菌水从PDA平板上洗下，摇匀后取lml悬浮液加入灭菌的试管中，分别置于50、55、60、65、70℃恒温水浴锅中分别处理5、10、15、20、25、30min后迅速冷却，然后倒入PDA平板上，并涂抹均匀，25℃下培养7-14d后，观察各菌生长情况。
2 结果与分析
2.1 温度对各菌生长的影响
图1-1、1-2、1-3的试验结果表明，三种曲霉菌的适宜生长温度存在明显差异，其中谢瓦散囊菌的生长温度为16-37℃，最适生长温度为22-31℃，在16℃和37℃下生长微弱；
匍匐散囊菌的生长温度为13-31℃，最适温度为22-28℃，在13℃和31℃下生长微弱；
溜曲霉的生长温度为16-43℃，最适温度22-37℃，在43℃下仍能微弱生长。结果还表明，在相同条件下，溜曲霉的生长速度比另外两种菌快得多，在22-28℃下培养10d，溜曲霉的菌落已基本长满整个平板（85mm），而另两种菌培养至14d，其净生长量仅为10多mm。
2.2 湿度对各菌生长的影响
表1结果表明，三种参试曲霉菌在相对湿度70%以下均不能生长，当相对湿度达75%时，除溜曲霉不能生长外，谢瓦散囊菌、匍匐散囊菌已开始生长，但生长速度很慢，而且相比之下，谢瓦散囊菌稍快，匍匐散囊菌较慢，二者均要在培养的第25d后才开始进入快速生长阶段。当相对湿度在82%时，三种参试菌均可生长，而且生长速度明显加快。在可生长的相对湿度以上，三种菌均表现相对湿度越高，生长速度越快的趋势。
注：表中符号“一”表示不生长；
“+”表示缓慢生长，菌落直径≤30mm；
“++”表示菌落直径＞30mm，但未长满平板：“+++”表示菌落已长满整个平板，但较稀疏；
“++++”表示菌落基本长满整个平板，且已丰满。
2.3 pH值对其生长的影响
从总体结果来看，三种参试曲霉菌对pH的适应范围都非常广，在pH2.5-11.5范围内，它们均能生长，匍匐散囊菌在pH3.0以上，溜曲霉在pH2.5以上，谢瓦散囊菌在pH4.0以上均能良好地生长。但不同曲霉菌也有一定差异，如培养7d后的结果，最适生长的pH范围匍匐散囊菌为4.5—9.0，溜曲霉为5.0-9.5谢瓦散囊菌为5.5-9.0。随着培养时间的延长，各菌的最适生长pH范围还会继续扩大，尤其向碱性方向扩大的区域更广，甚至表现无明显影响（详见图2-1，2-2，2-3）。
2.4 不同培养基对各菌生长的影响
2.4.1 在半组合、组合培养基上各菌生长的情况表2结果表明，培养7d或10d，溜曲霉在10%烟汁培养基上生长最好，其净生长量达38.5mm，基本长满整个培养平板，同时产生大量分生孢子；
匍匐散囊菌在NA培养基上生长最好，其次是10%烟汁和PDA两种，在CA培养基生长最差，谢瓦散囊菌在10%烟汁和CA培养基上生长最好，在5%烟汁培养基上生长最差。但培养至14d或21d后，匍匐散囊菌和谢瓦散囊菌的生长情况则与其培养7d时的生长情况不完全吻合，这可能与培养基营养成分被不同菌种消耗的速度不同有关（表2）。
2.4.2 在天然烟叶培养基上的生长情况在天然烟叶培养基上，三种曲霉均比在半组合、组合培养基上生长更快，菌丝更丰满，并产生大量的分生孢子。其中匍匐散囊菌和谢瓦散囊菌的生长速度比在半组合、组合培养基上加快更为明显，在天然烟叶培养基上培养7d，匍匐散囊菌的净生长量为26.5mm，已与在NA培养基上培养21d的净生长量28.9mm相当，谢瓦散囊菌的净生长量为31.0 mm，超过了所有在半组合、组合培养基上培养21d的净生长量。三种曲霉中仍以溜曲霉生长最快，培养5d其净生长量为31.5 mm，培养7d其净生长量为40.0mm。
2.5 致死温度和致死时间
测定结果，溜曲霉的致死温度和时间为60℃20rnin或65℃ 10min，匍匐散囊菌为65℃30min或70℃5min，谢瓦散囊菌为70℃ 15min。
3 结论与讨论
曲霉菌是诱致广西贮藏烟叶霉变的优势真菌类群。曲霉菌广泛存在于自然环境中，而且属于典型的腐生菌，所以只要条件适合，随时都会产生危害，而且发展速度很快，也不表现潜伏现象，一般仅需2—3d，烟叶表面即可看到霉变症状。综合测定结果表明，本研究的三种曲霉菌除对湿度要求比较高外，对其它条件的要求都比较宽松。
匍匐散囊菌和谢瓦散囊菌在空气相对湿度达75%以上、溜曲霉在空气相对湿度达82%以上时便可开始发生和蔓延，并随湿度增高，发展速度加快。温度虽不是霉变的主导因子，但在影响霉变程度中起重要作用。匍匐散囊菌、谢瓦散囊菌和溜曲霉的生长温度分别为13-31℃，16-37℃，16-43℃。所以，根据广西气象的实际情况，只要能满足湿度要求，常年都有使贮藏烟叶产生霉变的可能。
参试的三种曲霉在2001-2002年广西烟仓霉变生物种类普查中出现频率均较高，它们对酸碱度的适应能力非常强，在pH值2.5以上均能生长，可见它们颇具顽强的生命力。同时，它们在天然烟叶培养基上均比在半组合、组合培养基上生长更快，菌丝更丰满，并产生大量的分生抱子，也足以证明它们对贮藏烟叶具有很大的破坏力，尤其是溜曲霉，分布广，生长极为迅速，且极耐高温，在37℃下仍生长良好，在43℃下仍能微弱生长。所以，只要湿度适合，它们可在7-10d内使烟叶完全腐败，甚至变成烟泥，危害极大。
目前，我国各省对烟叶仓贮病虫害的研究仅在虫害方面有较多的报道，而霉变生物研究的报道则很少，只有云南省的王革等就云南发现的泡盛曲霉（A.awawori）等8种曲霉的形态特征、培养性状和河南的姜夫等及江苏的谢宗传等对卷烟防霉技术作过相关报道。
2001年，在广西区烟草公司的大力支持下，作者围绕广西烟仓霉变生物的种类鉴定、主要有害生物的生物学特性、霉变发生条件及防治技术展开了大量的调查和研究。本文就主要有害生物生物学特性的测定结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
选择2001-2002年广西烟仓霉变生物种类普查中出现频率较高的三种曲霉作供试菌，即溜曲霉（As-pergillustamariiKita，采自钟山县）、匍匐散囊菌原变种（Eurotium repens de Bary，为叙述方便，以下简称匍匐散囊菌，采自南宁市）、谢瓦散囊菌（Eurotium chevalieri Man-gin，采自南宁市）。各分离菌均先经单孢纯化并回接验证其致病性后移入PDA斜面上保存，试验前再移入PDA平板上25℃培养7d后供测定用。
1.2 培养基的制备
马铃薯（PDA）、肉汁胨（NA）、查氏（CA）等组合培养基按常规方法制作，半组合烟汁培养基是按每1000ml水加入所需烟叶（贮藏期烟叶）的百分含量煮沸30min，用纱布过滤，加水补足1000ml后，加入琼脂18g，121℃下湿热消毒20min制成；
天然烟叶培养基是按每三角瓶（300m1）装入贮藏烟叶（片烟）5g，再加入水20ml，121℃下湿热消毒20min制成。
1.3 温度对其生长的影晌
将直径5mm的菌苔移入PDA平板上，每皿一块，置于中央，分别在13℃、16℃、19℃、22℃、25℃、28℃、31℃、34℃、37℃、40℃、43℃、46℃和49℃ 13种温度下培养，分别于7d（溜曲霉）和7d，14d（匍匐散囊菌和谢瓦散囊菌）后测量菌落直径，计算其净生长量[（菌落直径—5mm）/21并作比较。每处理3皿，即3次重复（下同）。
1.4 湿度对其生长的影晌
先将贮藏的烟叶剪成直径约为85mm的圆片，并经湿热灭菌备用。试验在密闭容器（25×25×11cm3保鲜盒）中进行，以氯化钙等无机盐饱和溶液作湿度控制物（每盒200ml，测定仪为天津市气象海洋仪器厂生产的WHM5型温湿度表），试验设51%（氯化钙）、65%（碳酸钾）、70%（亚硝酸钠）、75%（氯酸钠）、82%（硫酸铵）、90%（硫酸锌）和94%（硫酸钙）7种湿度。测定时先将烟叶平放于培养皿内，然后移入直径5mm的菌苔，每皿1块，置于25℃下培养，分别于5d，10d，15d，20d，25d，45d后观察各菌的生长情况。
1.5 pH值对其生长的影晌
将直径5mm的菌苔移入pH值分别为2.5，3.0，3.5，4.0，45，5.0，55，6.0，6.5，7.0，75，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0，10.5，11.0和11.5的PDA培养基上，置25℃下恒温培养，分别于7d和10d后（溜曲霉）或7d，14d和21d后（谢瓦散囊菌和匍匐散囊菌）测量菌落直径，计算其净生长量并作比较。
1.6 不同培养基对其生长的影晌
将直径5mm的菌苔分别移入10%烟叶煎汁、5%烟叶煎汁、NA，PDA和CA等5种不同的培养基上，置25℃下恒温培养，分别于7d和10d后（溜曲霉）或7d，14d和21d后（谢瓦散囊菌、匍匐散囊菌）测量菌落直径，计算其净生长量并作比较。在天然烟叶培养基上的培养是将菌苔接种至三角瓶内烟叶表面的中央，每瓶一块，在同样温度下培养7d后观察菌体生长情况。
1.7 致死温度和时间的测定
将各菌的孢子连同菌丝用含1%吐温20的菌水从PDA平板上洗下，摇匀后取lml悬浮液加入灭菌的试管中，分别置于50、55、60、65、70℃恒温水浴锅中分别处理5、10、15、20、25、30min后迅速冷却，然后倒入PDA平板上，并涂抹均匀，25℃下培养7-14d后，观察各菌生长情况。
2 结果与分析
2.1 温度对各菌生长的影响
图1-1、1-2、1-3的试验结果表明，三种曲霉菌的适宜生长温度存在明显差异，其中谢瓦散囊菌的生长温度为16-37℃，最适生长温度为22-31℃，在16℃和37℃下生长微弱；
匍匐散囊菌的生长温度为13-31℃，最适温度为22-28℃，在13℃和31℃下生长微弱；
溜曲霉的生长温度为16-43℃，最适温度22-37℃，在43℃下仍能微弱生长。结果还表明，在相同条件下，溜曲霉的生长速度比另外两种菌快得多，在22-28℃下培养10d，溜曲霉的菌落已基本长满整个平板（85mm），而另两种菌培养至14d，其净生长量仅为10多mm。
图1-1 温度对谢瓦散囊菌（E. chevealieri）生长的影响
图1-2 温度对匍萄散囊菌（E. repens）生长影响
图1-3 温度对溜曲霉（A.tamarii）生长的影响
2.2 湿度对各菌生长的影响
表1结果表明，三种参试曲霉菌在相对湿度70%以下均不能生长，当相对湿度达75%时，除溜曲霉不能生长外，谢瓦散囊菌、匍匐散囊菌已开始生长，但生长速度很慢，而且相比之下，谢瓦散囊菌稍快，匍匐散囊菌较慢，二者均要在培养的第25d后才开始进入快速生长阶段。当相对湿度在82%时，三种参试菌均可生长，而且生长速度明显加快。在可生长的相对湿度以上，三种菌均表现相对湿度越高，生长速度越快的趋势。
表1 湿度对不同曲霉生长的影响
注：表中符号“一”表示不生长；
“+”表示缓慢生长，菌落直径≤30mm；
“++”表示菌落直径＞30mm，但未长满平板：“+++”表示菌落已长满整个平板，但较稀疏；
“++++”表示菌落基本长满整个平板，且已丰满。
2.3 pH值对其生长的影响
从总体结果来看，三种参试曲霉菌对pH的适应范围都非常广，在pH2.5-11.5范围内，它们均能生长，匍匐散囊菌在pH3.0以上，溜曲霉在pH2.5以上，谢瓦散囊菌在pH4.0以上均能良好地生长。但不同曲霉菌也有一定差异，如培养7d后的结果，最适生长的pH范围匍匐散囊菌为4.5—9.0，溜曲霉为5.0-9.5谢瓦散囊菌为5.5-9.0。随着培养时间的延长，各菌的最适生长pH范围还会继续扩大，尤其向碱性方向扩大的区域更广，甚至表现无明显影响（详见图2-1，2-2，2-3）。
图2-1 pH值对谢瓦散囊菌（E. chevalieri）生长的影响
图2-2 pH值对匍匐散囊菌原变种（E. repens）生长影响
图2-3 pH值对溜曲霉（A. tamarii）生长影响
2.4 不同培养基对各菌生长的影响
2.4.1 在半组合、组合培养基上各菌生长的情况表2结果表明，培养7d或10d，溜曲霉在10%烟汁培养基上生长最好，其净生长量达38.5mm，基本长满整个培养平板，同时产生大量分生孢子；
匍匐散囊菌在NA培养基上生长最好，其次是10%烟汁和PDA两种，在CA培养基生长最差，谢瓦散囊菌在10%烟汁和CA培养基上生长最好，在5%烟汁培养基上生长最差。但培养至14d或21d后，匍匐散囊菌和谢瓦散囊菌的生长情况则与其培养7d时的生长情况不完全吻合，这可能与培养基营养成分被不同菌种消耗的速度不同有关（表2）。
2.4.2 在天然烟叶培养基上的生长情况在天然烟叶培养基上，三种曲霉均比在半组合、组合培养基上生长更快，菌丝更丰满，并产生大量的分生孢子。其中匍匐散囊菌和谢瓦散囊菌的生长速度比在半组合、组合培养基上加快更为明显，在天然烟叶培养基上培养7d，匍匐散囊菌的净生长量为26.5mm，已与在NA培养基上培养21d的净生长量28.9mm相当，谢瓦散囊菌的净生长量为31.0 mm，超过了所有在半组合、组合培养基上培养21d的净生长量。三种曲霉中仍以溜曲霉生长最快，培养5d其净生长量为31.5 mm，培养7d其净生长量为40.0mm。
2.5 致死温度和致死时间
测定结果，溜曲霉的致死温度和时间为60℃20rnin或65℃ 10min，匍匐散囊菌为65℃30min或70℃5min，谢瓦散囊菌为70℃ 15min。
3 结论与讨论
曲霉菌是诱致广西贮藏烟叶霉变的优势真菌类群。曲霉菌广泛存在于自然环境中，而且属于典型的腐生菌，所以只要条件适合，随时都会产生危害，而且发展速度很快，也不表现潜伏现象，一般仅需2—3d，烟叶表面即可看到霉变症状。综合测定结果表明，本研究的三种曲霉菌除对湿度要求比较高外，对其它条件的要求都比较宽松。
匍匐散囊菌和谢瓦散囊菌在空气相对湿度达75%以上、溜曲霉在空气相对湿度达82%以上时便可开始发生和蔓延，并随湿度增高，发展速度加快。温度虽不是霉变的主导因子，但在影响霉变程度中起重要作用。匍匐散囊菌、谢瓦散囊菌和溜曲霉的生长温度分别为13-31℃，16-37℃，16-43℃。所以，根据广西气象的实际情况，只要能满足湿度要求，常年都有使贮藏烟叶产生霉变的可能。
参试的三种曲霉在2001-2002年广西烟仓霉变生物种类普查中出现频率均较高，它们对酸碱度的适应能力非常强，在pH值2.5以上均能生长，可见它们颇具顽强的生命力。同时，它们在天然烟叶培养基上均比在半组合、组合培养基上生长更快，菌丝更丰满，并产生大量的分生抱子，也足以证明它们对贮藏烟叶具有很大的破坏力，尤其是溜曲霉，分布广，生长极为迅速，且极耐高温，在37℃下仍生长良好，在43℃下仍能微弱生长。所以，只要湿度适合，它们可在7-10d内使烟叶完全腐败，甚至变成烟泥，危害极大。
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