富血小板纤维蛋白中生长因子含量及释放周期的实验研究
林盘玉 许 放 赵良军
广西医科大学第一附属医院骨科，广西南宁 530021
富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是第二代血小板浓缩物，含有转化生长因子-β3（transforming growth factor-β3，TGF-β3）、血小板源生长因子-AA（platelet-derived growth factor-AA，PDGF-AA）和胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor，IGF-1）等多种生长因子，当机体组织出现损伤后，血小板被激活并释放生长因子，在组织创面愈合、血管生成及成软骨分化等过程中发挥重要作用[1]。PRF在凝血酶的作用下形成非溶性纤维蛋白，纤维蛋白进而促进血小板聚集，随着时间的推移，纤维蛋白在一定时期内被逐步降解，血小板分批被激活，能有效提高生长因子释放和利用效率[2]。目前相关研究主要集中于观察富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）的短期效应，并没有充分观察整个释放时间段和释放趋势[3]，有必要深入研究PRP及PRF中生长因子释放量与释放时间的关联性及影响因素，有助于扩大临床应用范围和深度。本研究通过对比PRP与PRF中TGF-β3、PDGF-AA和IGF-1生长因子含量及释放周期，探讨PRF的临床应用优势。
1.1 分组
课题组招募10名健康志愿者，签署试验知情同意书，本研究资料的收集符合医院医学伦理委员会的规定。在双侧肘静脉抽取2管血液，每管各5 ml，按随机数表法将左右两侧2管静脉血分为PRP组和PRF组，在相同条件下制备成PRP和PRF检测样本，备用。
1.2 ELISA法测定PRF中TGF-β3、PDGF-AA和IGF-1浓度
1.2.1 制备培养液 ①从10名健康志愿者双侧肘静脉各获取5 ml血液；
②置入普通离心机内离心，制备PRP和PRF；
③收集EP管内液体并记录样本量，-80℃冰箱留存，标本溶液待测。
1.2.2 测定PRF中TGF-β3、PDGF-AA及IGF-1浓度 ①样品准备：将EP管取出并融化，设置离心参数为2000 r/min，离心20 min，取上清液；
②标准品准备：用1 ml的稀释溶液将标准品稀释到标准浓度，缓慢摇晃10 min，将原液稀释至10 ng/ml，然后在倍数比下稀释成以下浓度：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6 pg/ml，标准品的稀释液作为0 pg/ml；
③按照TGF-β3、PDGF-AA、IGF-1试剂盒（美国Sigma公司，美国，批号：BJ-E687473）进行操作，酶标仪测定OD值，绘制标准品及待测样本OD值浓度曲线。
1.3 PRF显微结构
使用JCM-7000扫描电子显微镜（日本Olympus株式会社，型号：JCM-7000）观察PRF的显微结构。①将离心好的PRF标本置入含有2.5%戊二醛溶液的容器内，固定24 h，依次用PBS缓冲液反复冲洗标本，各3次，每次5 min；
②将标本用25%、50%、75%、90%、100%不同浓度乙醇依次进行脱水，不同梯度每次15 min；
③将标本用20 nm金离子溅射进行包裹镀膜，于金属拖上将标本进行粘连，并做好标记；
④设置15 kV、8000×放大倍数等相关参数，应用扫描电子显微镜进行观察，采集PRF标本上、中、下3段的图像；
⑤对PRF标本图像进行分析，并描述显微结构特点。
1.4 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差（）表示，采用t检验，相关性采用Pearson分析，P＜ 0.05为差异有统计学意义。
2.1 PRP和PRF中TGF-β3、PDGF-AA和IGF-1的释放总量比较
PRP与PRF中TGF-β3、PDGF-AA、IGF-1的释放总量比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05），见表1。
表1 PRP和PRF中TGF-β3、PDGF-AA和IGF-1的释放总量比较（ng/ml，）
表1 PRP和PRF中TGF-β3、PDGF-AA和IGF-1的释放总量比较（ng/ml，）
注 TGF-β3：转化生长因子-β3；
PDGF-AA：血小板源生长因子-AA；
IGF-1：和胰岛素样生长因子-1；
PRF：富血小板纤维蛋白；
PRP：富血小板血浆
组别 TGF-β3 PDGF-AA IGF-1 PRP 组 385.3±36.8 113.8±17.4 102.4±12.5 PRF 组 401.8±43.4 128.5±19.1 109.8±14.7 t值 0.92 1.79 1.21 P值 0.37 0.08 0.24
2.2 PRP和PRF中生长因子释放周期情况
两组生长因子含量中TGF-β3最高，IGF-1次之，PDGF-AA最少；
PRP中生长因子3 d内达到释放高峰，1周内缓慢释放；
PRF中生长因子在1周内出现释放高峰，3周后释放趋于平稳，不同生长因子的释放高峰出现的时间点不同。
2.3 PRF结构
PRF呈淡黄色胶冻状，质地均匀，富有弹性，去除下层的红细胞碎块，双面加压后PRF呈膜片状物质，质地坚韧，主体部分呈淡黄色，下段少量红色（图1A～B）；
电镜扫描结果显示：PRF中胶原纤维束形态规则、结构清晰、表面光滑，纤维束之间相互交联缠绕，呈网状结构，内含血小板、白细胞和红细胞细胞等成分（图1C～D）。
血液主要由红细胞、白细胞、血小板和血浆等多种成分组成，其中红细胞约占44%，白细胞及血小板约占1%，通过设置不同离心参数，可制备出不同状态和结构成分的血小板浓缩物，包括PRP、PRF和生长因子浓缩物（concentrated growth factors，CGF），PRF是第二代血小板浓缩物，通过离心形成非纤溶性纤维蛋白，随着纤维蛋白逐步降解，滞纳于纤维蛋白内的血小板及白细胞逐渐被激活，进而释放生长因子[4-5]。
PRP和PRF中TGF-β3、PDGF-AA和IGF-1的释放曲线相似，释放总量一致，不同生长因子的释放高峰点及持续时间不同。PRF中3种生长因子释放总量对比，TGF-β3最高，IGF-1次之，PDGF-AA最少；
生长因子在1周内出现释放高峰，随后逐渐下降，3周后释放趋于平稳；
He等[6]研究发现PRF在2周内生长因子释放达到高峰，4周后释放趋于平稳，认为生长因子释放曲线具有一定的时间周期性，与本研究结果类似。本实验扫描电镜结果显示胶原纤维束呈网状交叉排列，直径1～2 μm、表面光滑，结构清晰、密度均匀、形态规则，内含大量细胞成分[7]。PRF横截面显示三维网状结构表面胶原纤维束密度及直径更大，中间更为疏松，纤维束间隙更大[8-9]，这种特殊构型可能是离心过程中纤维蛋白与离心管壁碰撞引起的，四周致密及中间疏松多孔可以容纳更多的小分子物质，聚集的血小板沿着纤维束之间呈归巢式排列[10-11]，血小板与生长因子通过化学键的方式聚集成块，表面致密的胶原纤维可以延缓血小板团块逃逸，随着纤维蛋白逐步降解，血小板被激活，从而延缓生长因子释放，特殊的三维网状构型是其发挥生物学作用的结构基础[12-13]。
PRF生长因子释放量及释放曲线受多种因素影响，生长因子主要来源于纤维蛋白、血小板、白细胞及其他成分，通过降低离心速度和缩短离心时间可以增加生长因子释放量，可能与包含更多未激活的白细胞有关，离心参数改变会引起网状构型变化，从而影响滞纳小分子物质的能力，其次，离心管类型也会影响血小板含量及分布[14]；
Kobayashi等[15]发现不同个体间血液成分也存在一定差异性，同样离心条件下PRF生长因子含量也不同，认为生长因子释放量受体内外多种因素影响。
综上所述，PRP和PRF能有效释放生长因子，且释放总量较为一致，但是由于PRF中纤维蛋白逐渐被降解，进而延长了生长因子的释放时间，其释放曲线具有一定的时间周期性。
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