外周血miR-92a和miR-342在急性肺损伤的诊断及预后中的临床价值
毕婧 黄波
安康市中心医院呼吸与危重症医学科一病区（陕西安康725000）
急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是由直接或间接损伤因素引起，如败血症、肺炎、吸入胃内容物、流行性病毒入侵、创伤、爆炸、烟雾吸入和窒息性吸入等，可能危及生命健康的疾病［1］。这些损伤因子诱导激活免疫细胞，随后启动异常免疫反应。由损伤因子激活的免疫细胞释放过量促炎因子、趋化因子和蛋白酶，最终损伤肺实质细胞，如血管内皮细胞和肺泡上皮细胞［2］。当肺实质细胞大量受损，导致通气功能障碍，呼吸功能迅速减弱。ALI 的特征包括肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞通透性增加、弥散性肺间质和肺泡水肿、气体交换障碍和低氧血症，最终导致呼吸衰竭［3］。目前，没有有效的药物治疗可提高ALI 患者生存率。微小RNA（microRNA，miRNA）是一种高度保守的单链RNA，长度约为22 个核苷酸，参与多种疾病的生理和病理功能，包括结核病［4］、ALI［5］、肺纤维化和肿瘤等［6］。miRNA 主要结合mRNA 的3′-非翻译区（3′-UTR），以控制多种途径和各种细胞过程，如炎症免疫反应等［7］。LIU 等［8］研究提出，miR-92a 在脓毒症引起的ALI 中介导肺部炎症，可能是ALI 的一种新的诊断生物标志物。miR-342在脂多糖诱导的小鼠ALI 中表达显著下调，而且发现miR-342 对A549 细胞炎症损伤具有保护作用［9］。本研究旨在评价ALI 患者外周血miR-92a和miR-342 表达水平，确定miR-92a和miR-342 对ALI诊断临床价值，并探讨miR-92a和miR-342 与ALI风险相关性。
1.1 一般资料筛选2019年1月到2021年12月期间在我院就诊的60 例ALI 患者，另选取同期在我院接受健康体检的同龄者52 例作为对照组，其中男32 例，女20 例，年龄（58.22±9.28）岁。60 例ALI 患者进行随访，并根据生存状态分为ALI 死亡组和ALI存活组，其中ALI死亡组20例，男12例，女8 例，患者年龄（57.23 ± 8.92）岁，ALI 存活组患者40 例，其中男25 例，女15 例，年龄（55.82 ±10.19）岁。
ALI 纳入标准：（1）符合ALI 诊断标准［10］；
（2）临床资料完整，且配合完成本研究所需所有检测；
（3）患者及其家属了解研究内容并签署家属知情同意书。排除标准：（1）合并其他恶性肿瘤者，包括肺癌、肾癌等；
（2）合并免疫性疾病者，包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等；
（3）长期服用药物者；
（4）与患者及其家属沟通不畅者。本研究内容符合赫尔辛基宣言，并获得本院伦理委员会批准。
1.2 临床指标观察和外周血采集
1.2.1 临床评分所有患者入院24 h 内进行急性生理和慢性健康评分（acute physiology and chronic health evaluation，APACHE Ⅱ）和肺损伤预测评分（lung injury prediction score，LIPS）。
1.2.2 外周血采集所有研究对象清晨空腹静脉抽血5 mL，利用生化检测仪分析超敏C反应蛋白（high-sensitive C-reactive protein，hs-CRP）。
1.2.3 实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）分析外周血miR-92a和miR-342 表达水平Trizol 提取各受试者外周血总RNA，利用反转录试剂盒（ThermoFisher，美国）将RNA 反转录为cDNA，在PCR 仪（UNOII，德国）上进行扩增，反应条件为：94 ℃，2 min，94 ℃持续30 s，循环35 次，退火温度为72 ℃，30 s，最后72 ℃持续7 min，以U6为内参，持续25 个循环。扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳中分离，用溴化乙锭染色，并用GelDoc 系统（Bio-Rad，美国）进行分析。引物信息为，miR-92a， 正 向 5′ - ACACTCCAGCTGGGAGGTTGGGATTTGTCGC 反向，5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA-TTCAGTTGAGA-3′；
miR-342，正向5′-TCCTCGCT-CTCACACAGAAATC-3′，反向5′-TATGGTTGTTCA-CGACTCCTTCAC-3′；
U6，正向5′-AACGAGACGACGACAGAC - 3′ ，反 向 5′ -GCAAATTCGTGAAGCGTTCCATA-3′。
1.3 统计学方法利用SPSS 20.0 进行统计学分析，计量资料采用（）表示，三组间比较采用单因素方差分析；
计数资料采用百分比表示，组间采用χ2检验；
利用受试者工作曲线（receiver operating characteristic，ROC）评价外周血miR-92a和miR-342 表达水平对ALI 诊断临床价值，单因素和多因素回Cox 归分析影响ALI 危险因素，以P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 一般资料比较本研究中对照组、ALI 存活组和ALI 死亡组患者年龄、性别、吸烟率以及原发疾病比较差异无统计学意义（P＞0.05），三组比较APACHEⅡ评分、LIPS 评分、CRP 差异有统计学意义（P＜0.05），与对照组相比，ALI 存活组和ALI 死亡组APACHEⅡ评分、LIPS 评分更高，外周血中hs-CRP 更高于对照组。见表1。
表1 一般临床资料比较Tab.1 Comparison of general clinical data 例（%）
2.2 外周血miR-92a和miR-342 表达水平比较对照组外周血中miR-92a 相对表达水平为（1.07 ±0.05），miR-342 相对表达水平为（1.12 ± 0.11）；
ALI存活组miR-92a 相对表达水平为（2.13 ± 0.12），miR-342 相对表达水平为（0.55 ± 0.04）；
ALI 死亡组miR-92a 相对表达水平为（3.11 ± 0.11），miR-342 相对表达水平为（0.31 ± 0.02）。ALI 存活组miR-92a相对表达水平高于对照组（P＜0.05），ALI 死亡组miR-92a 相对表达水平高于ALI 存活组（P＜0.05）；
ALI 存活组miR-342 相对表达水平低于对照组（P＜0.05），ALI 死亡组miR-342 相对表达水平低于ALI 存活组（P＜0.05）。
2.3 Cox 回归单因素分析ALI 患者外周血miR-92a、miR-342 相对表达水平、APACHEⅡ评分、LIPS评分、CRP 等因素纳入ALI 发生风险Cox 比例风险模型进行分析，单因素分析结果显示APACHE Ⅱ评分、LIPS 评分、外周血中CRP 浓度、miR-92a 相对表达水平过高，miR-342 相对表达水平过低是ALI 患者发生死亡风险的危险因素（P＜0.05），见表2。
表2 Cox 回归单因素分析Tab.2 Cox regression univariate analysis
2.4 Cox 回归多因素分析Cox 回归多因素分析结果表明，外周血CRP、miR-92a和miR-342 水平是影响ALI发生风险的独立危险因素（P＜0.05），见表3。
表3 Cox 回归多因素分析Tab.3 Cox regression multivariate analysis
2.5 外周血miR-92a和miR-342 水平诊断ALI 的ROC 分析根据ALI 诊断标准［11］，评价外周血中miR-92a和miR-342 相对表达水平对ALI 患者诊断临床价值，结果显示，miR-92a 曲线下面积为0.865（95%CI：0.722～0.902），灵敏度为84.39%，特异度为73.29%，截断值为2.16；
miR-342 曲线下面积为0.839（95%CI：0.728～0.950），灵敏度为82.19%，特异度为71.77%，截断值为0.56。miR-92a和miR-342 联合诊断曲线下面积为0.895（95%CI：0.855～0.963），灵敏度为86.87%，特异度为76.57%。见图1。
图1 miR-92a和miR-342 诊断ALI 的ROC 曲线Fig.1 ROC curve of miR-92a and miR-342 in the diagnosis of acute lung injury
本研究中发现miR-92a 在ALI 外周血中表达上调，miR-342 外周血中表达下调，进一步Cox 回归分析表明外周血CRP、miR-92a和miR-342 水平是影响ALI 发生风险的独立危险因素（P＜0.05），ROC 曲线分析结果表明，外周血miR-92a和miR-342 相对表达水平对ALI 诊断有临床价值。
ALI 是较为严重的健康问题，占肺损伤死亡例数的30%。从机制上讲，ALI 是一种临床呼吸系统疾病，可能发展为更为复杂的综合征，即急性呼吸窘迫综合征［12］。炎症反应在ALI 的发生和维持中起着重要作用，促炎细胞因子TNF-α 和IL-1β，增加肺上皮通透性，进而诱导肺组织损伤和中性粒细胞聚集导致肺水肿［13］。最近研究表明，miRNA 在ALI 进展过程中起着关键调控作用。一些研究报道了miRNA 作为ALI 生物标志的作用以及它们作为该疾病治疗靶点的潜在用途［14］。微阵列数据表明，ALI 诱导miRNA 异常表达，这些miRNA 的潜在靶点与许多生理病理过程相关，如炎症和凋亡［15］。CHEN 等［16］研究提出，MiR-92a 在非小细胞肺癌组织和细胞中表达上调，miR-92a 过度表达促进非小细胞肺癌增殖、侵袭和迁移，并抑制细胞凋亡。LIU 等［17］研究发现miR-92a 可激活肺泡巨噬细胞和肺部炎症，肺泡上皮细胞外泌体中的miR-92a 可能代表了ALI 的一种新的诊断生物标志物［8］。ALI中miR-92a 在ALI 中高表达，抑制miR-92a 可改善肺泡上皮细胞的氧化应激和炎症反应，减少凋亡。本研究与上述报道一致，miR-92a 在ALI 进展中可能发挥重要调控作用，这种调控作用可能与ALI炎症反应有关。
除此之外，研究表明miR-342 也是ALI 炎症反应的关键调节因子，ZHU 等［9］提出miR-342 在LPS诱导的A549 细胞中表达显著下调，且伴有炎性因子升高和细胞凋亡，而过表达miR-342 可降低LPS诱导的炎症水平。WEN 等［18］报道miR-342 与Ⅱ型肺泡上皮细胞增殖和凋亡有关，在支气管肺发育不良疾病治疗中有一定前景。MiR-342 过度表达抑制NF-κB/p65 信号通路，促进百草枯诱导的细胞凋亡和氧化应激，并加重百草枯诱导的肺损伤［19］。本研究结果与上述报道一致，miR-342 在ALI 患者外周血中表达下调，而且在ALI 死亡组患者表达低于ALI 存活组。上述研究说明miR-342在ALI 进展中可能发挥炎症有关的调控作用。
本研究尚存在不足之处，ALI 临床样本收集存在一定难度，后期研究过程中继续增加样本量，提高严谨性。另外，对于miR-92a和miR-342 在ALI中的具体分子机制仍需深入探究，进一步充实研究内容。综上所述，外周血miR-92a和miR-342 水平与ALI 有关，二者联合检测可为ALI 早期预测提供临床依据。
【Author contributions】BI Jing performed the experiments，designed the study and wrote the article.HUANG Bo revised and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as sub-mitted.
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