长管红山茶叶片的化学成分研究
王介华，张文华，肖 强，吴增宝，崔令军*
1湖北民族大学风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室，恩施 445000；
2石河子大学药学院，石河子 832000
长管红山茶CamellialongitubaChang为山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)多年生小乔木，最早为1990年中山大学张宏达教授报道[1]，模式标本采自湖北恩施地区。据《中国植物志》第四十九卷第三分册记载，山茶科植物约有36属、700种，山茶属是山茶科中最大的一个属，山茶属植物在我国有238种，主要分布于西南至东南部，以云南、广西、广东及四川最多[2]。山茶属植物中的化学成分主要为黄酮类、皂苷类、多酚类、植物甾醇类、脂肪酸类和生物碱类等，其中黄酮类成分主要是黄酮醇类，以槲皮素、山柰酚以及儿茶素最为常见；
皂苷类成分主要为齐墩果烷型的五环三萜皂苷。生物活性表现在抗菌、抗突变、抗癌、抗溃疡、抗氧化、降血脂等多方面[3]。
尿素通道蛋白家族(urea transporters，UTs)是一种转运尿素(urea)的通道蛋白分子，目前已表征的包括UT-A(UT-A1、UT-A2、UT-A3、UT-A4、UT-A5和UT-A6)、UT-B两个家族[4]，其在肾内尿素循环过程中起重要作用，建立肾髓质组织尿素浓度梯度并参与尿浓缩机制[5]。UT-B敲除模型小鼠的肾内髓组织尿素浓度和渗透压降低，且尿浓缩能力下降并不影响其他肾功能和机体的其他主要溶质(Na+、K+、Cl-)的清除率[6]。所以，UT-B抑制作用可以在既不引起钾流失，也不影响体液电解质平衡的情况下增加尿量，本研究通过红细胞裂解模型进行UT-B抑制剂的筛选。
1.1 仪器与材料
薄层色谱分析板(孔山市上段新材料有限公司)；
暗箱式紫外分析仪(ZF-20D，巩义市予华仪器有限责任公司)；
Bruker DRX 400 MHz超导核磁共振仪(德国Bruker公司，四甲基硅烷(TMS)为内标)；
GF254薄层色谱硅胶(青岛海洋化工厂)；
半制备高效液相色谱仪(HPLC,岛津LC-20)；
高速逆流色谱仪(HSCCC，TBE-300C，上海同田生物技术有限公司)；
酶标仪(1510，赛默飞世尔)；
96孔板(美国康宁公司)；
二甲基亚砜(DMSO)(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)；
有机溶剂为国药集团上海试剂厂产品，其他试剂为分析纯。
长管红山茶叶片于2019年5月采自湖北省恩施土家族苗族自治州恩施市白果乡，植物标本经湖北民族大学吴增宝副教授鉴定为山茶科山茶属植物长管红山茶CamellialongitubaChang。标本(H20210206)保存于风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室。
1.2 实验与方法
1.2.1 提取与分离
长管红山茶叶片阴干粉碎，取10 kg，纯水回流提取3次，每次2 h，趁热过滤，滤液浓缩得浸膏900 g。浸膏硅胶拌样，采用硅胶柱层析梯度洗脱二氯甲烷/甲醇(10∶1→1∶1)，TLC检识合并得到2个组分A和B。
A经MDS-300甲醇水(3∶1→1∶1)梯度洗脱，得3个组分依次为Fr.A-1～3，A-1经Sephadex LH-20甲醇水(3∶1→1∶1)洗脱得Fr.A-1-1～12，其经半制备HPLC纯化得化合物3(88 mg，tR= 23 min)和4(54 mg，tR= 36 min)。A-3经反相甲醇水(3∶1→1∶1)梯度洗脱得Fr.A-3-1～17。A-3-6经凝胶甲醇水(1∶1)洗脱重结晶得化合物5(963 mg)和7(26 mg)。A-2经凝胶甲醇水(1∶1)洗脱得Fr.A-2-1～8，Fr.A-2-3经反相甲醇水(1∶1)得Fr.A-2-3-1～13。Fr.A-2-3-8经半制备HPLC纯化得化合物1(27 mg，tR= 16 min)。
B经MDS-300甲醇水(10∶1→1∶1)梯度洗脱得B-1～10，B-5经中压反相甲醇水(10∶1→1∶1)梯度洗脱得B-5-1～13，B-5-3经凝胶甲醇水(1∶1)洗脱得B-5-3-1～7，B-5-3-3经半制备HPLC纯化得化合物6(41 mg，tR= 19 min)，B-5-3-4经重结晶得化合物2(32 mg)。B-7经反相甲醇水(10∶1→1∶1)得B-7-1～12，B-7-5经凝胶甲醇水(1∶1)得B-7-5-1～9，B-7-5-4经凝胶甲醇水(1∶1)等度洗脱得B-7-5-4-1～7，B-7-5-4-3经HSCCC分离得化合物8(11 mg，tR= 12 min)、9(8 mg，tR= 18 min)、10(43 mg，tR= 23 min)和11(9 mg，tR= 28 min)。
B-8经MDS-300甲醇水(10∶1→1∶1)梯度洗脱得Fr.B-1～9，Fr.B-8-3经Sephadex LH-20凝胶甲醇水(1∶1)等度洗脱得Fr.B-8-3-1～19，Fr.B-8-3-5经凝胶甲醇水(1∶1)洗脱得Fr.B-8-3-5-4，Fr.B-8-3-5-7。Fr.B-8-3-5-4经半制备HPLC乙腈水(1∶1)等度纯化得化合物13(23 mg，tR= 15 min)。Fr.B-8-5经反相甲醇水(10∶1～1∶1)梯度洗脱得Fr.B-8-5-1～12，Fr.B-8-5-7经凝胶甲醇水(1∶1)洗脱得Fr.B-8-5-7-1～14，Fr.B-8-5-7-9、Fr.B-8-5-7-10经半制备HPLC甲醇水等度纯化得化合物12(7 mg，tR= 14 min)和14(13 mg，tR= 22 min)。Fr.B-8-8经反相甲醇水(1∶1)等度洗脱得Fr.B-8-8-1～9，Fr.B-8-8-6经凝胶甲醇水(1∶1)等度洗脱得Fr.B-8-8-6-1～3，Fr.B-8-8-6-5经半制备HPLC甲醇水纯化得化合物15(18 mg，tR= 20 min)。
1.2.2 UT-B抑制物质筛选
将人血样肝素钠抗凝处理，离心15 min(3 000 r/min)弃上清，加入10倍体积的等渗磷酸盐缓冲液(PBS)，离心15 min弃上清。将高渗PBS与红细胞按照50∶1混合后在室温下孵育2 h。每个化合物分高浓度(100 μg/mL)和低浓度(50 μg/mL)振荡培养6 min，使用酶标仪在710 nm波长下检测吸光度(OD)值，选择OD值下降明显的化合物进行梯度实验，调整红细胞悬液和化合物的比例，取25 μL化合物，加入175 μL红细胞悬液中，混合轻微震荡6 min，取上述化合物和红细胞的混合液20 μL，加入到180 μL的等渗PBS中，终浓度分别为：500、250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL，在710 nm波长下检测OD值，按以下公式计算出化合物各浓度的抑制率：抑制率=(ODDMSO-OD样品)/(ODDMSO-0.045)×100%，取量效关系明显的化合物计算IC50，DMSO为对照。
2.1 结构鉴定
化合物1淡黄色粉末；
分子式为C9H8O3；
1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.51(2H，d，J= 8.5 Hz，H-2′，6′)，7.49(1H，d，J= 15.6 Hz，H-2)，6.79(2H，d，J= 8.5 Hz，H-3′，5′)，6.29(1H，d，J= 15.6 Hz，H-3)；
13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：170.4(C-1)，118.2(C-2)，146.6(C-3)，127.7(C-1′)，132.5(C-2′，C-6′)，117.8(C-3′，C-5′)，162.0(C-4′)。以上数据与文献[7]报道一致，故鉴定化合物1为对羟基肉桂酸(结构见图1)。
图1 化合物1～15的结构Fig.1 Structures of compounds 1-15
化合物2淡黄色粉末；
分子式为C21H20O12；
1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.61(1H，dd，J= 8.6，1.9 Hz，H-2′)，7.54(1H，d，J= 1.9 Hz，H-6′)，6.82(1H，d，J= 8.6 Hz，H-5′)，6.41(1H，d，J= 1.8 Hz，H-6)，6.20(1H，d，J= 1.8 Hz，H-8)，5.37(1H，d，J= 7.7 Hz，H-1′′)，3.26～3.65(1H，m，H-3)；
13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：157.6(C-2)，134.8(C-3)，178.8(C-4)，162.5(C-5)，100.0(C-6)，165.5(C-7)，94.9(C-8)，157.7(C-9)，105.2(C-10)，122.4(C-1′)，116.5(C-2′)，146.2(C-3′)，149.8(C-4′)，117.3(C-5′)，123.3(C-6′)，103.2(C-1′′)，72.5(C-2′′)，74.5(C-3′′)，69.3(C-4′′)，77.1(C-5′′)，61.5(C-6′′)。以上数据与文献[8]报道一致，故鉴定化合物2为槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷。
化合物3黄色结晶；
分子式为C15H10O7；
1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.09(1H，s，5-OH)，7.86(1H，d，J= 2.5 Hz，H-2′)，7.59(1H，dd，J= 8.5，7.0 Hz，H-6′)，6.90(1H，d，J= 8.5 Hz，H-5′)，6.43(1H，d，J= 2.4 Hz，H-8)，6.18(1H，d，J= 2.4 Hz，H-6)；
13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：145.5(C-2)，136.2(C-3)，176.3(C-4)，156.6(C-5)，98.8(C-6)，164.3(C-7)，95.3(C-8)，164.0(C-9)，104.1(C-10)，123.6(C-1′)，114.7(C-2′)，147.3(C-3′，C-4′)，115.9(C-5′)，121.2(C-6′)。以上数据与文献[9]报道一致，故鉴定化合物3为槲皮素。
化合物4白色结晶；
分子式为C15H14O6，+0.4°(c 0.1，CH3OH)；
1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.69(1H，d，J= 8.8 Hz，H-5′)，6.59(1H，dd，J= 8.4，2.0 Hz，H-6′)，6.72(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′)，5.89(1H，d，J= 2.4 Hz，H-6)，5.69(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8)，4.48(1H，d，J= 7.6 Hz，H-2)，3.82(1H，td，J= 15.6，7.6 Hz，H-3)，2.66(1H，dd，J= 15.2，5.2 Hz，H-4′)，2.35(1H，dd，J= 16.0，8.0 Hz，H-4)；
13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：81.5(C-2)，66.8(C-3)，28.0(C-4)，156.9(C-5)，95.7(C-6)，156.6(C-7)，94.3(C-8)，155.8(C-9)，99.5(C-10)，131.1(C-1′)，115.5(C-2′)，145.3(C-3′)，145.3(C-4′)，115.0(C-5′)，118.9(C-6′)。以上数据与文献[10]报道一致，故鉴定化合物4为(+)-儿茶素。
化合物5白色结晶；
分子式为C7H6O4；
1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.38(1H，d，J= 2.1 Hz，H-4)，7.33(1H，dd，J= 8.2，2.1 Hz，H-2)，6.81(1H，d，J= 8.2 Hz，H-6)；
13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：122.3(C-1)，117.0(C-2)，150.4(C-3)，145.3(C-4)，115.7(C-5)，122.5(C-6)，168.0(C-7)。以上数据与文献[11]报道一致，故鉴定化合物5为原儿茶酸。
化合物6黄色粉末；
分子式为C9H6O4；
1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.72(1H，s，-OH)，8.18(1H，d，J= 5.9 Hz，H-2)，6.36(1H，d，J= 2.1 Hz，H-8)，6.27(1H，d，J= 5.9 Hz，H-3)，6.20(1H，d，J= 2.1 Hz，H-6)；
13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：157.9(C-2)，111.0(C-3)，181.7(C-4)，162.2(C-5)，99.6(C-6)，165.4(C-7)，94.6(C-8)，158.4(C-9)，105.3(C-10)。以上数据与文献[12]报道一致，故鉴定化合物6为5，7-二羟基色原酮。
化合物7黄色结晶；
分子式为C27H30O16；
1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.54(1H，dd，J= 8.0，2.4 Hz，H-6′)，7.51(1H，d，J= 2.4 Hz，H-2′)，6.85(1H，d，J= 8.2 Hz，H-5′)，6.38(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8)，6.18(1H，d，J= 2.0 Hz，H-6)，5.33(1H，d，J= 7.6 Hz，H-1′′)，4.37(1H，d，J= 1.6 Hz，H-1′′′)，3.42(10H，m)，0.98(3H，d，J= 6.2 Hz，H-6′′′)；
13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：158.2(C-2)，135.2(C-3)，178.6(C-4)，162.8(C-5)，98.8(C-6)，165.8(C-7)，94.9(C-8)，158.6(C-9)，105.1(C-10)，122.8(C-1′)，115.3(C-2′)，145.1(C-3′)，148.6(C-4′)，116.1(C-5′)，120.8(C-6′)，104.8(C-1′′)，75.2(C-2′′)，78.3(C-3′′)，71.5(C-4′′)，77.3(C-5′′)，68.7(C-6′′)，101.6(C-1′′′)，75.6(C-2′′′)，72.5(C-3′′′)，72.8(C-4′′′)，68.7(C-5′′′)，17.6(C-6′′′)。以上数据与文献[13]报道一致，故鉴定化合物7为芦丁。
化合物8黄色粉末；
分子式为C16H12O7；
1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.73(1H，d，J= 2.2 Hz，H-5)，7.61(1H，dd，J= 8.5，2.2 Hz，H-6′)，6.96(1H，d，J= 8.5 Hz，H-2)，6.48(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8′)，6.25(1H，d，J= 2.0 Hz，H-6)；
13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：147.1(C-2)，136.1(C-3)，176.2(C-4)，156.6(C-5)，98.6(C-6)，164.3(C-7)，93.8(C-8)，161.1(C-9)，103.4(C-10)，122.4(C-1′)，115.4(C-2′)，145.4(C-3′)，148.0(C-4′)，115.9(C-5′)，120.5(C-6′)，56.7(OCH3)。以上数据与文献[14]报道一致，故鉴定化合物8为3-O-甲基槲皮素。
化合物9淡黄色粉末；
分子式为C12H8O5；
1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.17(1H，s，9-OH)，8.18(1H，d，J= 9.8 Hz，H-5)，8.05(1H，d，J= 2.3 Hz，H-2)，7.30(1H，d，J= 2.3 Hz，H-3)，6.33(1H，d，J= 9.8 Hz，H-6)，4.10(3H，s，4-OCH3)；
13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：146.7(C-2)，104.2(C-3)，115.3(C-3a)，146.7(C-4)，105.8(C-4a)，140.4(C-5)，112.9(C-6)，160.4(C-7)，141.7(C-8a)，125.9(C-9)，147.5(C-9a)，61.5(OCH3)。以上数据与文献[15]报道一致，故鉴定化合物9为9-羟基-4-甲氧基补骨脂素。
化合物10淡黄色固体；
分子式为C10H8O4；
1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.83(1H，s，5-OH)，6.33(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8)，6.18(1H，d，J= 2.0 Hz，H-6)，6.08(1H，s，H-3)，2.35(3H，s，CH3)；
13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：168.1(C-2)，108.4(C-3)，182.2(C-4)，158.2(C-5)，99.2(C-6)，164.6(C-7)，94.2(C-8)，162.0(C-9)，103.8(C-10)，20.4(-CH3)。以上数据与文献[16]报道一致，故鉴定化合物10为去甲丁香色原酮。
化合物11黄色粉末；
分子式为C15H12O5；
1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.17(1H，s，H-5)，7.32(2H，d，J= 8.2 Hz，H-2′，6′)，6.97(2H，d，J= 8.2 Hz，H-3′，5′)，5.89(1H，d，J= 3.0 Hz，H-6)，5.46(1H，d，J= 3.0 Hz，H-8)，5.42(1H，dd，J= 12.9，2.9 Hz)，3.28(1H，dd，J= 17.2，12.9 Hz)，2.67(1H，dd，J= 17.2，2.9 Hz)；
13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：78.9(C-2)，42.4(C-3)，196.9(C-4)，163.4(C-5)，95.4(C-6)，167.2(C-7)，96.3(C-8)，164.0(C-9)，102.2(C-10)，129.3(C-1′)，128.8(C-2′，6′)，115.6(C-3′，5′)，158.2(C4′)。以上数据与文献[17]报道一致，故鉴定化合物11为柚皮素。
化合物12黄色结晶；
分子式为C15H10O6；
1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：8.00(2H，m，H-2′，6′)，6.88(2H，m，H-3′，5′)，6.39(1H，d，J= 2.2 Hz，H-6)，6.14(1H，d，J= 2.2 Hz，H-8)；
13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：147.3(C-2)，136.2(C-3)，176.4(C-4)，164.6(C-5)，98.8(C-6)，159.7(C-7)，94.0(C-8)，156.7(C-9)，103.5(C-10)，122.2(C-1′)，130.0(C-2′，6′)，116.0(C-3′，5′)，161.2(C-4′)。以上数据与文献[18]报道一致，故鉴定化合物12为山柰酚。
化合物13白色粉末；
分子式为C15H14O6，+0.4°(c 0.0082，CH3OH)；
1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.85(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′)，6.63(1H，d，J= 8.0 Hz，H-6′)，6.60(1H，dd，J= 8.0，2.0 Hz，H-5′)，5.85(1H，d，J= 2.3 Hz，H-8)，5.67(1H，d，J= 2.3 Hz，H-6)，4.63(1H，m，H-2)，3.96(1H，s，H-3)，2.63(1H，dd，J= 16.3，4.5 Hz，H-4b)，2.46～2.41(1H，m，H-4a)；
13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：78.6(C-2)，65.4(C-3)，28.7(C-4)，156.3(C-5)，95.6(C-6)，156.8(C-7)，94.6(C-8)，157.1(C-9)，99.0(C-10)，131.1(C-1′)，115.3(C-2′)，145.0(C-3′)，145.0(C-4′)，118.5(C-5′)，115.4(C-6′)。以上数据与文献[19]报道一致，故鉴定化合物13为(-)-表儿茶素。
化合物14白色粉末；
分子式为C7H6O5；
1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.91(2H，s，H-2，6)；
13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：120.9(C-1)，109.2(C-2，6)，145.9(C-3，5)，138.5(C-4)，168.0(C=O)。以上数据与文献[20]报道一致，故鉴定化合物14为没食子酸。
化合物15黄色粉末；
分子式为C15H10O8；
1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.20(2H，s，H-2′，6′)，6.33(1H，d，J= 2.1 Hz，H-6)，6.14(1H，d，J= 2.1 Hz，H-8)；
13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：147.4(C-2)，136.4(C-3)，176.3(C-4)，156.6(C-5)，98.7(C-6)，164.4(C-7)，93.7(C-8)，161.2(C-9)，103.5(C-10)，121.3(C-1′)，107.7(C-2′，6′)，136.4(C-3′，5′)，146.2(C-4′)。以上数据与文献[21]报道一致，故鉴定化合物15为杨梅素。
2.2 UT-B抑制活性物质筛选
以健康成人红细胞为实验材料，710 nm测定各化合物的吸光度(OD)值，计算抑制率。抑制率高于40%的化合物视为具有UT-B抑制活性，得到化合物3、7、13、14和15抑制率高于40%，具有UT-B抑制活性。其中量效关系明显的是化合物14和化合物15，化合物14对红细胞抑制率的IC50为2.373 μg/mL，化合物15对红细胞抑制率的IC50为2.521 μg/mL，有利尿活性。
长管红山茶作为山茶属的新成员，其化学成分此前一直处于空白状态。为进一步探讨长管红山茶药效基础物质，本研究对其化学成分进行研究，得到了15个单体化合物，其中9个黄酮类化合物，3个酚酸类化合物，2个色原酮及其衍生物，1个香豆素类化合物，并结合质谱、核磁共振波谱等技术阐明了其化学结构。15个化合物均是首次从长管红山茶植物中分离得到，且化合物1、6、7、8、9、10和11为首次从山茶属中分离得到。从所分离得到的化合物类型来看，和山茶属的化合物类型基本吻合，以黄酮和酚酸类为主。对化合物进行UT-B抑制活性物质筛选，结果表明没食子酸(14)和杨梅素(15)具有较明显的利尿活性。因此在后续工作中应对此类化合物的作用机制进行深入的研究。本文为长管红山茶的药理研究提供了物质基础，也为长管红山茶的开发应用提供参考。
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