HIF与肾细胞癌关系的研究进展
夏旺宁，王超奇
（1.内蒙古民族大学临床医学院，内蒙古 通辽 028000 ；
2.永州市中心医院，湖南 永州 425000 ；
3.内蒙古民族大学附属医院，内蒙古 通辽 028000）
氧是生物生长和发育的重要元素之一，与细胞的代谢及生理过程息息相关。缺氧时在细胞水平发生的一系列代偿适应性反应多是通过基因水平的改变来实现的，目前已知缺氧可诱导上百种基因的表达，并且刺激生成厌氧代谢酶，这是细胞在缺氧状态下生存的原因，这些基因统称为缺氧相关基因[1]。缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）是调控相关基因表达的重要转录因子之一。缺氧是诱导肿瘤细胞生成的常见因素之一，削弱甚至阻碍了癌症的治疗如化疗、放疗和免疫治疗等的疗效，因此了解细胞缺氧的机制对于医学的发展非常重要[2]。肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是泌尿系统中一种发病率较高的恶性肿瘤，通常分为乳头状肾癌、透明细胞性肾癌、集合管系统肾癌、嫌色细胞肾癌和其他类型肾癌，其中以透明细胞肾癌（clear cell RCC，ccRCC）最为常见。全球每年大约有43 万人被诊断出RCC，其中约有18万人因此病而死亡[3]。近几年来，肾癌的发病率不断增高。超过60% 的患者经手术治疗预后良好，但仍有一部分患者在就诊时就已进展为晚期RCC，这些患者只有通过综合治疗才能改善预后，因而与RCC 有关的靶向治疗及靶向基因的研究逐渐成为热点。已有研究发现，Von Hippel-Lindau（VHL）基因以及HIF与RCC 的发生发展有关。本文重点就HIF 与RCC 关系的研究进展进行综述。
1991 年，Semenza 等[4]在缺氧环境下发现一种蛋白质复合物能与特定DNA 片段结合，并能够随着氧气浓度的变化做出相应的改变，他们将这种特定的DNA 片 段 称 为“Hypoxia response element，HRE”，称这种复合物为“Hypoxia-inducible factors，HIF”（缺氧诱导因子），从而开启了氧感知领域的研究。紧接着在1995 年，Semenza 团队对HIF 进行了进一步的研究，并纯化解析了该转录因子蛋白复合体，他们发现HIF 是由两种不同的蛋白组成，分别为转录因子HIF-1α 和ARNT。随后科学家们很快找到了HIF-1α 和VHL 蛋白的联系。HIF 由两个基本的螺旋-环-螺旋（bHLH）蛋白组成。目前的研究表明，HIF 主要包含三种不同的HIF-α 因子 ，即HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α，以及两种HIF-β 因子：HIF-1β 和HIF-2β，不同的因子具有不同的功能活性和特异性[5]。HIF-1α 和HIF-2α 两者都有NTAD 和CTAD两个结构域来转录激活，当与DNA 结合时可激活转录。但有反式激活能力的HIF-α 蛋白异构体可被HIF-3α 竞争性抑制[6]，因为其经过较多的mRNA 剪接，所以无反式激活结构域。
HIF 发挥功能与VHL 基因有一定关联。2001年，Kaelin 团队和Ratcliffe 团队经过研究发现，在正常的氧浓度下，HIF-1α 的两个特定位点上会被添上羟基（脯氨酰羟化），这一改变使得VHL 能够识别并结合HIF-1α ；
在没有氧气状态下，HIF-1α 不会与VHL 结合，而是直接进入细胞核，并与一些特定的基因组结合，从而激活、调节体内多种基因的功能，促进氧气的供应与运输[7-8]。VHL 基因的起始密码子可以编码多功能蛋白pVHL，这种蛋白与ccRCC 的发生发展相关，同时pVHL 蛋白和elongin B、elongin C、Cul2Rbx1 也是泛素化连接酶复合物底物的识别亚基[9]。在有氧情况下，pVHL 结构域识别并结合被脯氨酰羟化酶（PHD）羟化的HIF-α 亚单位和脯氨酰残基，并通过pVHL-HIFα 功能区与E3 泛素连接酶复合物，将多聚泛素化尾共价到HIF-α 亚单位上，以便于被26S 蛋白酶体识别并降解与pVHL 结构域结合的HIF-α 亚单位[10]。当然残留的天冬酰胺酰羟化酶1（FIH-1）也可以使HIF-α 羟基化，从而降低CTAD 活性。这种天冬酰胺酰羟基化反应需要分子内有氧环境，这点与脯氨酰羟化酶引起的羟基化反应类似[11]，但是FIH-1 在缺氧情况下也能有一定活性使HIF-α 稳定，从而调节缺氧反应[12]。通常细胞只有在缺氧时HIF 才升高，而当pVHL 异常时，细胞在任何环境中都有高水平的HIF。HIF-α 与pVHL 蛋白在缺氧或细胞中pVHL 蛋白缺失的情况下发生分离，与HIF-β 亚基二聚化并转录激活100 ～200 个基因，当中包含部分适应低氧环境的基因。在缺氧条件下，PHD 和FIH 两者的氧酶活性减弱，HIF-α 变得稳定并易位到细胞核中，与ARNT 二聚化，并结合缺氧反应元件（HREs）激活细胞特异性以适应缺氧[13]。另外也有研究显示，其他某些癌基因的激活变异、抑癌基因的失活变异，也可以使HIF-α 的表达或其活性升高[14]。
目前已明确缺氧与肿瘤有一定的联系。RCC 的患病率与VHL 等位基因不同有关，也与蛋白质的损害程度、HIF 的调节规律有相关性[15]。不同的VHL基因型，对HIF 传导途径具有不同的影响。RCC 的典型特征之一是高频VHL 失活，尤其ccRCC 的高频VHL 失活率更是达90% 以上，VHL 蛋白失活会影响HIF-α 的降解途径，造成HIF-α 在有氧时聚集[16]，这也是RCC 发生的主要原因。有研究表明，HIF-1α 和HIF-2α 与RCC 的发生率呈正相关，认为HIF-1α 和HIF-2α 均促进了RCC 的发生，因此可以通过观察血清HIF-1α、HIF-2α 水平的高低筛查RCC[17]。尽管RCC 的发生风险与HIF-α 失调的相关性不是绝对的，但HIF 途径在RCC 的发病机制中仍是重要和必需的。HIF-α 不同类型在ccRCC 中具有不同的作用。有研究表明，具有HIF-2α 表达的癌症与更大的肿瘤体积相关，含有HIF-1α 基因的14号染色体区域的缺失是RCC 的共同特征[18-19]。HIF-1α 的缺失直接导致蛋白表达异常，这种14q 的缺失常常提示RCC 患者的预后欠佳。通过对VHL 缺失的ccRCC 患者进行研究得知，许多患者表达HIF-2α但并不表达HIF-1α，而在去除了HIF-2α 缺失型VHL 的细胞系后，仍可以像恢复了pVHL 蛋白的功能一样在裸鼠身上形成肿瘤。相反，表达过多的HIF-2α 而非HIF-1α，可以掩盖pVHL 蛋白的抑癌作用[20]。HIF-2α 可通过影响组蛋白修饰而参与RCC的发生[21]，降低细胞中HIF-2α 的含量可明显抑制RCC 的发展，因此靶向HIF-2α 被看作是RCC 治疗的重要策略[22]。
HIF 与RCC 关系密切，通过选择能抑制HIF 或HIF 靶基因作用的药物，可以为RCC 的治疗找到新的方法。目前已有一些HIF 抑制剂进入了临床研究阶段，如伊维莫司和坦西莫司治疗已转移的RCC 效果显著。针对低氧性肿瘤细胞及HIF 的治疗策略主要包括使用低氧激活前药、抑制HIF 二聚体形成、抑制HIF 的mRNA 或蛋白表达、抑制其DNA 结合能力和转录活性等。目前HIF 抑制剂的靶向目标大多为HIF-1α 及HIF-2α 亚型[23]。HIF 的两个亚型经充分研究，发现其主要功能是调节葡萄糖代谢和血管生成。肿瘤血管生成由血管内皮生长因子（VEGF）调控为主，而VEGF 由HIF-1 和HIF-2 调节。HIF 还可调节像葡萄糖转运蛋白和乳酸脱氢酶等参与糖酵解级联反应的基因。此外，HIF 也可调节参与其他抗癌疗法的相关基因，如放疗、化疗及免疫治疗等[24-25]。
3.1 HIF-2α 与RCC 的治疗
以往，HIF-2α 被认为是无法制成药物的。然而，基于HIF-2α/HIF-1β 异二聚体形成过程中PAS-B结构域的特征，进一步根据HIF-2α 的PAS-B 与抑制剂的多重相关因素如选择特异性、结合能力、口服吸收效果等，从而确定PT2385 和PT2977 两种化合物作为抑制剂。与前者相比，后者的药代动力学和体内生物利用率均更佳，这是因为PT2385 是体外实验用抑制剂，而PT2977 作为临床药物使用。体外实验表明，PT2385 和PT2977 可高效抑制HIF-2α/HIF-β 异二聚体形成及DNA 结合活性，最终实现抑制HIF-2α 靶基因表达的目的；
两种抑制剂的作用效果还具有较强的选择性，尽管HIF-1α 和HIF-2α 蛋白序列具有高度同源性，但二者在PAS-B 结构方面存在一定的差别，因此PT2385/PT2977 只抑制HIF-2α 与HIF-1β 结合，并降低HIF-2α 靶基因的表达，但不影响HIF-1α 的生理功能[26]。HIF-2α 驱动ccRCC 和药物抑制反应的基因产物VEGF 是RCC 治疗的基石，HIF-2α 在RCC 中似乎是异质性的。此外，在临床前模型中，p53 通路突变可导致对HIF-2α 的抗性，这就证实了预测性生物标志物需要优化使用HIF-2α 拮抗剂的临床研究[27]。
3.2 HIF-1α 与RCC 的治疗
前面已述，缺氧条件下HIF-1α 可在肾癌细胞中高度表达，因此对HIF-1α 及其介导的相关蛋白进行靶向药物研究是肿瘤治疗新的研究方向。HIF-1α途径相关蛋白较多，且这些蛋白有着不同的功能，如VEGF 能促进血管生成，与代谢相关的葡萄糖转运体1（GLUT1），维持酸碱平衡的碳酸酐酶Ⅸ（CA Ⅸ），维持细胞生长的胰岛素生长因子1（IGF1），都是分子靶向药物开发的重要靶点[28]。调控细胞生长与增殖的一个关键通路是哺乳动物雷帕霉素蛋白信号通路mTOR（mammalian target of rapamycin），此外细胞能量代谢的重要通路是以mTOR 为中心的PI3K/AKT/mTOR 信号通路，并且mTOR 通过多种作用途径影响和调节HIF-1α 及其下游基因的表达，以调节HIF-1α 上游信号通路。因此，mTOR 抑制剂在低氧肿瘤的治疗中被广泛关注，如有显著抗肿瘤效果的雷帕霉素类化合物[28-30]。由于缺氧调节关键因子HIF-1α 的抑制与抗肿瘤活性之间关联甚少，因此以HIF-1α 为直接作用靶点的分子靶向药物相对较少。此外，一些HIF-1α 的选择性抑制剂并没有表现出对低氧肿瘤细胞的选择性作用。基于HIF-1α 的作用机制与抗肿瘤效果之间的关系尚未清楚，故对HIF-1α 的靶向治疗仍需要大量研究。
目前RCC 的一线治疗方案对70% 的个体可以产生作用，但最终多数个体病情进展[31]。研究表明，具有HIF-1 和HIF-2 高度表达的肿瘤患者治疗效果及预后很差，HIF 能作为肿瘤治疗反应评估的生物标志物[17]。虽然目前以HIF-2α 为靶点的药物在肿瘤治疗方面取得了不错的进展，但HIF 与肿瘤放化疗、免疫治疗和靶向药物治疗抵抗仍然是面临的难题。晚期或转移性RCC 患者的5 年生存率仅为8%，且RCC对放化疗不敏感，因此靶向治疗和免疫治疗成为手术后辅助治疗或无法手术患者的首选治疗策略[32]。多种药物目前处于临床研究阶段，实际应用面临许多挑战，一方面仅有较少患者能对这些药物产生完全反应，另一方面治疗过程中出现的药物抵抗和耐药性使得肿瘤患者的病情进一步加重，因此需要研发更多、更好的RCC 治疗药物。相信未来随着对HIF 研究的逐步深入，相关药物的出现将给RCC 的治疗带来新的希望。
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