微生物挑战实验在食品安全控制方面的研究进展
张祁，韩琳琳，张红雨，裴晓燕，黄小平，韩晓旭，尹睿杰，郑艳琴
（1.内蒙古伊利实业集团股份有限公司,呼和浩特 010110；
2.内蒙古乳业技术研究院有限责任公司，呼和浩特 010110）
近年来，天然成分和清洁标签的概念日益为消费者所熟知，并且清洁标签连续登上Innova“全球食品饮料十大趋势预测”。消费者对食品安全的要求越来越高，使得食品生产企业面临更多新的挑战，一方面要生产天然健康的产品，另一方面又要保证产品货架期的安全性。目前的食品安全，特别是微生物往往过多地依赖于终产品检测，实际上食品中微生物的控制在最初选料、制定配方、选择工艺、设计关键控制点和设计卫生清洁方案的时候就应该开展[1]。
微生物挑战实验可以为食品企业提供产品安全和质量保证的有效信息，更多地了解产品中微生物的特性，包括工艺的杀菌效果、产品配方或者本身的特性对腐败和致病微生物的抑制效果，企业的卫生和清洁方案是否达到预期的效果[2]。微生物挑战实验研究的设计、实施和评估是一项复杂的任务，取决于食品如何研发、生产、包装、运输、储藏和消费，如果在实验设计中没有考虑到具体的食品和环境因素，可能导致有缺陷的结论。本文综述了微生物挑战实验在食品安全控制方面的适用范围，详述了微生物挑战实验的步骤及核心要点，并对微生物挑战试验在食品安全评估、研发配方设计、生产工艺验证等方面的最新研究动态和应用成果进行介绍，以期对食品行业微生物安全控制提供新思路。
1.1 定义
微生物挑战实验是通过接种相关微生物并在特定条件下储藏，模拟食品在生产、加工、运输和后续的再加工过程中受到微生物污染的情况，考察食品防腐体系的抑菌效果，从而保证货架期内食品微生物指标的安全性[3]。该实验能够模拟食品的生产和使用过程中受到高强度微生物污染的潜在可能性和自然界中微生物生长的最适条件，使得测试结果更接近“残酷的现实”，能经受“严峻的考验”，从而保证食品避免由微生物污染造成的损失和保障消费者的健康[4]。
1.2 分类
按照微生物挑战实验的目的不同，可分为食品加工过程的安全性验证、食品存储条件和食品货架期验证[5]。其中食品加工过程的安全性验证，可分为物料杀菌工艺挑战测试（如UHT、巴氏杀菌等）、包材杀菌工艺挑战测试、无菌灌装环境挑战测试；
而货架期挑战实验主要用于评估产品货架期微生物安全性。
通常下列几种情况可考虑开展微生物挑战实验[6]：（1）判断食品是否能达到预期的货架期，或者发现食品不能达到既定的货架期，希望验证新的包装材料或者储藏温度是否能延长货架期达到预定的时间范围；
（2）由于食品在销售过程中比较容易受到微生物的再污染，可以通过微生物挑战实验研究食品配方（如酸碱度、水分活度、防腐剂和盐分等）能否抑制微生物的生长和毒素的产生；
（3）如果既往经验表明某种特定的致病菌对食品存在潜在的危害，可以通过微生物挑战实验判断生产工艺或者设定的CCP点能否杀灭特定的致病菌；
（4）验证所使用的清洗消毒措施是否达到了预期的微生物控制效果。
并非所有的食品都需要开展微生物挑战实验，以下几种情况不推荐开展微生物挑战实验。（1）当食物的特性可以抑制微生物生长时，不需要进行微生物挑战实验研究。例如，没有必要评估p H值为3.5的产品是否支持沙门氏菌的生长，因为沙门氏菌不会在p H如此低的情况下生长。表1列出了常见病原菌的生长p H和水分活度。（2）其他条件相同的情况下，选择更适合微生物生长条件的挑战实验的数据即可，其他条件不需要重复开展测试。例如，对p H为5.8的食品配方中特定致病菌的微生物挑战实验研究的结果可以应用于pH为5.4的相似配方中，对于涉及相似组分、酸度和水分活度（Aw）的多种配方，只需测试最有利于微生物生长或存活的配方即可。
表1 常见病原菌的生长pH值及最低生长水分活度（Aw）[7]
结合美国、欧盟等权威机构发布的指南[6,8]、国内外相关研究[9]和企业应用实践，总结微生物挑战实验的主要步骤。
3.1 目标微生物的选择
目标微生物的选择优先考虑相同配方产品中分离的菌株，如果既往经验表明某种特定的微生物一直与食品的变质有关，那么这种微生物是最适合的接种物[10]。此外，可以选择食品加工环境、原辅料等分离出来的菌株。若针对该类别产品未能分离得到菌株，则可以通过查阅食品安全数据库（如欧盟食品及饲料快速警报系统、美国FDA通报等）或检索已发表文献，识别目标微生物。
当天然分离物无法获得时，可选择使用标准菌株（如ATCC、CMCC等）作为替代菌株。但是，与天然分离物相比，标准菌株的延迟期更短，生长速率也更快，这可能会影响微生物挑战实验的结果，可能发生达到特定数量微生物的时间与实际情况不完全一致。此外，当病原菌不能在加工厂使用时，可以使用其他种类的替代菌株，例如使用生孢梭菌（Clostridium sporogenes）替代肉毒杆菌（Clostridium botulinum）、英诺克李斯特氏菌（Listeria innocua）替代单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）替代沙门氏菌（Salmonella）[11]。
理想的致病菌替代菌株应具备以下特征：①没有致病性；
②具有稳定和一致的生长或生存特性，如暴露于相同的配方或处理因素(p H、温度敏感性、耐氧性等)时，与目标病原体有很强的相似性；
③失活特性和动力学与目标病原体相似；
④具备易于培养、时间稳定、种群密度高，在混合环境中易于计数和区分；
⑤基因稳定，可确保结果的可重复性，不受实验室或实验时间的影响；
⑥应激和损伤敏感性与目标病原体相似[12]。
3.2 菌液制备
当菌株从冷冻或冻干状态复苏时，应在非选择性生长培养基中连续转接一到两次。转接次数应尽量减少，以避免影响菌株表型特性的遗传变化。AOAC国际实验室指南[13]指出，标准菌株的转接次数不应超过5次，多次转接容易丢失质粒或其他遗传标记。
菌株的培养需要在每个菌株的最佳生长条件下进行。在大多数情况下，复苏在菌株最佳生长条件下培养18～24 h；
针对于某些菌株（例如某些酵母）也会使用48或72 h的培养。菌悬液的制备可以通过培养液和平板培养两种方式获得，相关研究结果表明通过平板上收集的菌体比在培养液中收集的菌体具有更强的生存潜力，可以代表微生物挑战实验中最坏的情况[14]。
3.3 接种方法
微生物挑战实验主要分为混合菌种接种法和单菌种接种法，通过在待测样品中接种一种或多种微生物，放置微生物于最适宜的条件下培养，观察待测样品不同时间内微生物总数，评估待测食品防腐体系的抑菌效果[15]。由于混合接种法更能代表实际污染的条件和状况，因此混合接种的方法更容易被生产企业所采用和接受[16]。在混合接种培养时，可能会存在一定程度的竞争生长，特别是在使用革兰氏阴性菌株混合的情况下，导致其他混合菌的生长慢一些。为了尽量减少菌株竞争的影响，建议尽可能避免混合革兰氏阴性菌株[6]。
接种体积也是影响实验成功的关键参数。应尽可能减少所用菌液的体积，同时确保食品特性发生最小的变化。通常，接种体积不应超过食物体积的1%，甚至更少[14]。接种后需要确保接种物均匀分布在食品中，以最大限度地减少后续对挑战生物体的取样和计数的错误，同时最大限度地使微生物暴露在食品环境中。可通过无菌注射、浸渍、雾化等方式对样品进行接种[17]。
3.4 接种量
食品每单位重量或体积的接种量必须符合实际，并与微生物挑战实验的目的直接相关。如果实验的目的是评估一种食品在特定时期内的安全性和稳定性，初始接种量应在每克或每毫升食品100～1 000 CFU之间[6]。如果微生物腐败菌经常导致产品变质或预计产品内腐败菌数量并不多，则需要将接种量加倍或者降低，例如Uyttendaele等[18]在肉制品单增李斯特氏菌的研究中采用低接种量（1～10 CFU/g）。而在开展微生物杀菌验证时，接种量可以达到每克或每毫升食品106～108CFU或者更多，以证明挑战微生物的对数下降。例如，低酸性罐头食品中肉毒梭菌12D的降低，即食冷冻食品中的单核增生李斯特菌6D的降低，巴氏杀菌乳中沙门氏菌10D的降低[19]。
3.5 持续时间
微生物挑战实验的持续时间取决于产品当前的或期望的货架期，需要覆盖以上所有的时间，并且还应包括此时间以外的安全裕度，以保证消费者存储产品超过包装建议使用货架期的情况。根据食品的货架期，微生物挑战试验持续时间建议比食品的预期货架期长25%（例如，货架期为3～6个月的食品）至50%（例如，货架期为7～10 d的食品）[6]；
也有研究直接按照1.3倍货架期进行测试[9]。对于一些在预期货架期结束时仍然具有可接受感官特性的食品，可以继续研究直至发生明显的腐败，以对某些消费者可能会继续消费食品直到其出现腐败的情况进行安全评估。
3.6 采样间隔
根据微生物挑战实验的持续时间，采样需要覆盖储存期间所有具有代表性的时间点。如果食品的保质期较短，则需要每天抽样；
如果食品的保质期较长，则需要每周抽样1至2次。在微生物挑战实验中，样品至少需要5到7个采样点才能准确地给出接种物在储存期间的变化趋势；
如果食品的保质期长，可能需要至少7个以上的采样点。当挑战研究过程分析微生物的量已经达到每克或每毫升食品108CFU时，就没有必要继续取样[6]。
可复制性是微生物挑战实验准确、有效的重要因素。理想情况下，应在每个采样点进行二到三次平行测试，结合企业生产实践对于关键的采样点甚至可以提高到5次平行测试。在每个采点样应分析未经接种处理的对照样本，以确定货架期内背景微生物的情况。
3.7 储存条件
接种食品的存储需要复制食品在正常存储条件下可能暴露的条件。此外，还应考虑在运输或零售过程中储存条件发生改变的最坏可能性。储存条件，特别是储存温度，会严重影响微生物挑战实验的持续时间。挑战研究中使用的储存温度应代表食品在销售和储存期间暴露的预期温度范围。湿度也应被视为储存条件的一个因素，对于含水率会随环境湿度条件的变化而变化的食品，微生物挑战实验研究的条件应包含代表性的环境湿度变化。
微生物挑战实验研究还需要考虑其他储存条件，包括包装的类型和包装内气体的性质。理想情况下，测试样品应保存在与售卖相同的包装中。如果商业食品是真空包装或气调包装（MAP），那么微生物挑战研究的样品应该使用相同的包装或包装膜。
3.8 结果分析
在微生物挑战实验开始之前，非常重要的是确定食品通过和失败的标准。目前还没有适用于所有结果分析的原则，需微生物专家结合食品安全标准、企业控制要求、配方组成和售卖条件等情况明确指导意见。一般来说，在整个食品预期的货架期和重复实验中，微生物的生长增加超过1～2个LOG，或者在连续两个抽样间隔的样本中检测到毒素，或者产品已严重腐败，不再适宜食用，则可终止微生物挑战实验研究[20]。对于致病菌有更为严格的要求，国际食品法典委员会发布的指南（CAC/GL 61-2007），针对不支持单增李斯特氏菌生长的即食食品，要求至少在制造商标识的预期货架期内，单增李斯特的增长水平不应超过0.5 log CFU/g[21]。
4.1 食品安全评估
为了保障即食食品安全，欧盟、加拿大等政府分别制定了微生物挑战实验指南。欧盟发布了《即食食品中单核细胞增生李斯特菌的挑战测试能力实验室实施评估指南》，目的是制定统一的方法，评价进行微生物挑战实验的实验室能力，以符合欧盟EC 2073/2005条例中规定的食品安全标准[22]。加拿大发布《即食食品的肉毒梭菌挑战测试》，以确定肉毒梭菌是否能在即食食品中生长并产生毒素[23]。
国内外相关研究运用微生物挑战实验进行安全性评估。Gérard等[24]通过挑战实验测定不同类型奶酪中单核增生李斯特菌的生长潜力，采用3种菌株的混合菌对32个工厂生产的奶酪进行分析，评估半硬质乳酪的安全性。王铁龙等[25]通过建立一套风险挑战方法对酿造酱制品进行研究，根据食品的目标菌酵母菌和金黄色葡萄球菌，结合食品情况分析出最大污染程度进行接种，测定相关指标，得出酿造酱制品对酵母菌和金黄色葡萄球菌具有抑制作用。
4.2 研发配方设计
微生物挑战实验在研发确定食品配方微生物安全和稳定性方面提供关键信息，挑战实验可以帮助回答特定的食品配方是否有利于或抑制其生长；
在更改选用原料和配方时，是否可以保障产品货架期稳定。
李文茹等[4]在广东某调味品厂酱油更换新的防腐剂配方后，对该酱油新的防腐体系的抑菌效果进行了微生物挑战实验研究，从添加防腐剂的成品酱油中进行了微生物的筛选和菌种鉴定，并对该酱油的防腐体系进行了微生物挑战实验和抗二次污染实验研究，对该酱油的防腐体系的抑菌效能做出合理的评价。黄小青等[26]利用微生物挑战实验探究了传统豆酱的防腐体系对不同微生物的抑制效果，在无菌条件下，分别向等量的传统豆酱中接入产膜酵母、米曲霉菌和耐盐性乳酸菌菌悬液，密封放置，观察不同时期传统豆酱微生物菌落总数变化情况。研究结果表明，传统豆酱密封条件下，其防腐体系在28 d内可将产膜酵母、米曲霉以及耐盐性乳酸菌的浓度从104CFU/g降低到小于10 CFU/g。与密封条件相比，敞口条件下其防腐体系对产膜酵母及耐盐性乳酸菌具有相同的杀菌能力，然而米曲霉在28 d后仍有7.9×102CFU/g，表明传统豆酱在封口条件下对霉菌、酵母和乳酸菌都有明显抑制效果。
4.3 生产工艺验证
微生物挑战实验可以用来验证生产工艺和设定的关键控制点，对指导生产和卫生清洁方案改进有积极作用，通过数据支撑为生产工艺验证提供保障；
微生物挑战实验在验证针对目标微生物或目标生物群体的致死率也起着重要的作用，特别是新的杀菌工艺的引入，往往通过挑战试验进行验证。
食品企业在开展杀菌工艺验证时，通常会接种阳性菌株以验证设备的杀菌效率。吕晓英[27]等采用微生物挑战试验对猕猴桃汁射频杀菌工艺进行研究，通过正交实验得出射频杀菌的最优条件为：极板间距105 mm、处理时间210 s、猕猴桃汁厚度为45 mm，该条件下射频处理可使猕猴桃汁中的沙门氏菌下降8个以上数量级。Wei xinxiao等[28]利用微生物挑战试验研究了水活度对奶粉中沙门氏菌热失活动力学的影响，将脂肪含量不同的两种奶粉（分别为0.62%和29.46%wt/wt），脱脂奶粉和全脂奶粉，分别接种5株沙门氏菌混合物，并于3个水分活度（0.10、0.20、和0.30)，3种温度梯度（75、80和85℃）进行杀菌处理，研究结果表明沙门氏菌的耐热性随着水分活度的降低而显着增加，这表明在低水分活度下需要更高的温度或更长的加工时间才能实现所需的沙门氏菌灭活。
4.4 包装安全性评估
食品包装是食品的外部保护，是食品免受微生物污染的重要屏障，随着新型包装材料和形式的推广使用，食品的保质期得到了极大的延长，挑战试验可以验证更换包装后的微生物安全性。
近年来，食品用抗菌包装的研究逐渐成为热点，例如金属氧化物纳米颗粒（如银、铜、锌等）与微生物直接相互作用并表现出优异的抗菌效率，Jian等[29]开展的挑战实验表明，含有纳米氧化锌的包材对致病菌有很强的抑制作用，接种109CFU/mL大肠杆菌和金黄色葡萄球菌货架期的抑菌率分别达到99.20%和84.70%，证明新包材的应用可有效延缓产品变质过程。邓雯瑾等[30]对百里香精油抗菌涂层包装的抑菌性进行了研究，将生菜悬浮于荧光假单胞菌悬浮液进行接种，常温静置15 min以去掉多余的水分，使初始接种量为104～105CFU/g，分别在4℃下保藏1～5 d，结果表明在贮藏第1天，抗菌薄膜包装后样品中荧光假单胞菌比PE保鲜膜组低4.25个对数值，显著低于PE保鲜膜组(P＜0.05)，说明抗菌包装能有效抑制鲜切生菜中荧光假单胞菌的生长。
4.5 货架期安全性评估
如果食品被致病菌或腐败微生物污染，可以利用微生物挑战实验判断货架期是否稳定。微生物挑战实验研究也有助于确定某些冷藏或常温储存食品的潜在保质期。
康奈尔大学Buehler等[31]采用微生物挑战实验的方法向希腊酸奶中接种酵母和霉菌混合物（包含5种酵母菌和1种霉菌），其接种浓度为101和103CFU/g，分别代表低水平和高水平的霉菌和酵母污染，以评估货架期内添加菌种保护剂和不添加菌种保护剂对霉菌和酵母的抑制情况，结果表明所评估的2种市售菌种保护剂可控制霉菌的表面生长，但在7℃保藏超过76 d时，不能抑制酵母的生长。Varalakshmi等[32]通过微生物挑战实验确认食品在4℃条件下保质期内是否支持单核增生乳杆菌的生长，并评估食品工业通常使用的保存技术对控制食品中单核增生乳杆菌的生长是否有效。
随着产品口味的多样化及加工过程的复杂化，随之而来的微生物风险不断增加，对产品微生物风险控制形成了巨大的挑战。消费者对健康食品的偏好也增加了对新配方的安全性和稳定性的验证要求。微生物挑战实验作为一种有效的工具，可以为生产企业评估产品配方、生产加工工艺、以及货架期微生物安全性等关键问题，进而为配方设计、生产线上建立关键控制点提供强有力的数据支撑和有效指导[20]。
但微生物挑战实验也有其局限性，整个实验过程长，且测试成本较高。此外，微生物挑战实验设计的难度在于没有标准统一的方法，需要专业人员根据产品特点、工艺参数、运输和储存条件，以及可能污染的途径等对不同的产品给出特定的方案和选择适当的目标微生物。为了提升食品研发效率，大幅缩短货架期研究时间，生产企业迫切需要微生物挑战实验的数据开发预测微生物模型，通过模型更加快速的评估研发、储运和零售环节产品的安全性。
猜你喜欢货架配方挑战一招值千金 配方建奇功河北理科教学研究(2020年3期)2021-01-04绝密配方(下)小学科学(学生版)(2020年2期)2020-03-03绝密配方(上)小学科学(学生版)(2020年1期)2020-01-19邵国胜：实现从“书架”到“货架”的跨越科学中国人(2018年1期)2018-06-08投资无人货架适合吗？中国储运(2018年4期)2018-04-08货架行业:需求变化带动创新发展物流技术与应用(2017年3期)2017-05-17电化学阻抗法预测油脂货架期中国粮油学报(2015年5期)2015-02-06第52Q 迈向新挑战当代体育·扣篮(2014年8期)2014-05-23配方小说月刊(2014年9期)2014-04-20