野生和养殖丁肠道微生物菌群的比较分析
钱 逸，许沁宇，钱 龙，艾 涛，向 伟，胡伯林，王 军，王成辉
( 1.上海海洋大学，农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，水产科学国家级实验教学示范中心，上海水产养殖工程技术研究中心，上海 201306；
2.新疆生产建设兵团水产技术推广总站，新疆 乌鲁木齐 830002 )
鱼类肠道是重要的消化吸收器官，而肠道微生物是其重要的组成部分，其在肠道内的定殖和稳态对宿主具有重要意义，在食物消化、营养吸收、免疫抗病等方面发挥重要的调控作用，对鱼类生长发育具有不可替代的作用[7-8]。鱼类的生活环境、饲料来源、发育时期、生理状态等因素均会对其肠道微生物组成产生影响，如不同环境下生长或不同生长时期的鱼类肠道微生物组成有明显差异[9-11]。陈孝煊等[12]研究发现，水体的盐度和温度均会影响鱼类的肠道菌群结构的形成。其次，在河流、湖泊等大型水体中，水流速度较快，有机质含量相对较少，而在养殖水体中，水流较缓、投喂饲料单一且固定、养殖密度大等使有机质含量相对野生环境较丰富。李秀玲等[13]分析不同脂肪源对鱼类肠道菌群的影响时发现，饲料中脂肪源类型可以改变鱼类肠道微生物的多样性和丰富度。目前，肠道微生物的研究已在鱼类的饲料开发、养殖管理等方面发挥着越来越重要的作用。
1.1 样品采集
1.2 DNA提取和16S rRNA测序
使用DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒)对20个肠道样品进行DNA抽提，利用NanoDrop 2000平台测定DNA的浓度与纯度。对检测合格的DNA，利用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物对16S rRNA基因的V3～V4区进行PCR扩增。构建配对末端测序文库(PE300)并在Illumina MiSeq(上海美吉生物医药科技有限公司)上进行测序。
1.3 测序数据处理与分析
原始测序序列使用Fastp v0.19.6软件质控和过滤低质量的序列，利用Flash v1.2.11软件对测序获得的成对序列进行拼接。拼接后的序列使用Uparse软件，按照97%相似性对非重复的序列进行运算分类单元聚类。采用RDP classifier贝叶斯算法对运算分类单元代表序列进行注释和分类学分析。使用Mothur 1.30.2软件计算各组的Alpha多样性指数。而组间的差异菌群使用Wilcox秩和检验的方法，进行显著性差异检验，以P<0.05为显著差异。Beta多样性分析利用QIILME软件进行计算，基于abund_jaccard距离，利用主坐标分析进行组间样本肠道菌群结构的展示，并结合相似性分析(ANOSIM)检验评估菌群结构差异的显著性。
2.1 样本序列统计
图1 野生丁和养殖丁各样本肠道内容物的稀释曲线
图2 野生丁和养殖丁肠道微生物运算分类单元的分布维恩图
2.2 肠道微生物多样性分析
图3 野生丁和养殖丁肠道微生物的Beta多样性分析
表1 野生丁和养殖丁肠道微生物Alpha多样性的统计分析
2.3 野生丁和养殖丁肠道微生物组成和差异
图4 野生丁和养殖丁肠道菌群在门水平上的组成和丰度(a)及Wilcoxon秩和统计学检验(b)
图5 野生丁和养殖丁肠道菌群在属水平上的组成和丰度(a)及Wilcoxon秩和统计学检验(b)
图6 种水平下，野生丁和养殖丁肠道菌群Wilcoxon秩和统计学检验
3.1 门水平下肠道菌群结构