角蛋白18的功能及在肿瘤诊疗中的研究应用
王居鹏综述，任丽审校
（1.天津医科大学肿瘤医院检验科，国家肿瘤临床医学研究中心；
天津市“肿瘤防治”重点实验室；
天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津 300060；
2天津中医药大学第二附属医院检验科，天津 300250）
角蛋白（keratin）也被称为细胞角蛋白（cytokeratin，CK），是上皮细胞的中间丝（intermediate filament，IF）形成蛋白，在上皮细胞和内皮细胞中表达。作为细胞骨架蛋白，角蛋白可维持细胞和组织结构的完整性，保护上皮细胞免受机械和非机械应激源的伤害[1]。此外，它还参与调控细胞信号转导，影响细胞周期及调控细胞相关蛋白的合成，与细胞的分裂、运动、分化、凋亡等过程相关，其异常表达可导致相应恶性肿瘤的发生。角蛋白18（keratin 18，K18）是构成细胞中间丝蛋白的主要成分之一，在大多数器官的正常上皮细胞中表达，但在正常鳞状上皮中不表达。研究表明，在115种肿瘤类型中至少有90种（78.3%）偶见K18阳性；
37种（31.9%）常见K18阳性，包括肺腺癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌以及卵巢癌等[2]。本文现就K18的结构、分布、功能及其在肿瘤诊疗的作用作一综述。
哺乳动物共有54种角蛋白，包括28种Ⅰ型角蛋白和26种Ⅱ型角蛋白。Ⅰ型角蛋白相对分子质量小，呈酸性，除了K18，所有Ⅰ型角蛋白的基因均被定位在染色体17q；
而Ⅱ型角蛋白相对分子质量较大，呈碱性，其基因被定位在染色体12q[3]。一般来说，大多数的Ⅰ型角蛋白会和一个特定的Ⅱ型角蛋白以细胞类型或组织特异性的方式形成不同的异源二聚体。所有的角蛋白都由一个长约310～315残基的α-螺旋中央结构域（被称为“杆”）和位于N末端和C末端大小不一、高度可变的非螺旋结构域（分别称为“头”和“尾”）组成[4]，其分子大小、等电点、免疫原性的不同与末端结构域的大小不同相关。K18属于Ⅰ型酸性角蛋白，由位于染色体12q13.13的基因编码，mRNA长度1 407 bp，含8个外显子，可编码430个氨基酸，相对分子量为48 058。
K18和其丝状配偶体-角蛋白8（K8）是最常见的中间丝家族成员，两者是胚胎发育过程中表达的第一对蛋白。K18和K8主要表达于单层上皮组织，如胃肠道、乳腺、肺等[5]，而成人肝细胞，只表达K18和K8[3]。
K18是构成细胞骨架的结构蛋白，对组织的完整性起着至关重要的作用，同时可调节细胞分裂、迁移、分化和凋亡。
2.1 调节细胞有丝分裂 细胞周期阶段之间的单向过渡受可逆磷酸化和蛋白质水解控制，在细胞进入、通过、退出有丝分裂的过程中，可发生超过32 000次蛋白磷酸化/脱磷酸化[6]。角蛋白的磷酸化发生在它们的N端结构域和C端结构域，这两个位置最具异质性，也最可能影响组织特定功能。Ser-52和Ser-33是K18的两个主要磷酸化位点。中心粒复制是细胞有丝分裂过程中的重要过程，S期中心粒复制开始，G2期中心粒成熟，有丝分裂期中心粒分离，在有丝分裂结束时，子代中心粒与原中心粒脱离。磷酸化的Ser-52以细胞周期依赖性的方式聚集在原中心粒的近端，在细胞周期的S期和G2/M期动态增加，在保持原-子代中心粒的紧密结合中发挥关键作用[7]。研究表明，Ser-33磷酸化调控K18与14-3-3蛋白的结合，可能部分调节肝细胞有丝分裂进程，与有丝分裂期间14-3-3蛋白的核再分布有关，过表达Ser-33小鼠的肝部分切除不影响肝脏再生，但可导致有丝分裂停止，出现异常的有丝分裂[8]。
2.2 调节细胞迁移Ser-29、Ser-30和Ser-48是K18上的糖基化位点，它们和K18的磷酸化位点Ser-52和Ser-33可增加K18的溶解度，并调节其稳定性和纤维组成。Kakade等[9]研究发现，Ser-30糖基化修饰促进Ser-33的磷酸化，以此可调节K18的功能，影响细胞迁移过程。Yusuke等[10]的研究中，可通过敲除细胞中K18基因来增加细胞的集体迁移速度。Wang等[11]研究提示，K18是微管蛋白的上游信号，微管蛋白聚集会抑制细胞转移，siRNA敲除k18基因可抑制微管蛋白的表达，增加癌细胞的转移。
2.3 调节细胞凋亡和细胞死亡 血液循环中K18片段的含量与上皮细胞的凋亡、自噬、坏死、死亡形式相关。细胞凋亡过程中，K18被活化的半胱天冬酶3、7和9裂解产生一个含有特异的Asp396新抗原表位的片段，被称为M30片段[12]，是细胞凋亡的标志物。而细胞死亡时，不会发生这种改变。细胞坏死时，释放的完整K18蛋白或新表位蛋白片段称为M65，是细胞坏死的标志物。可以通过死亡肿瘤细胞释放的K18的分子形式来判断细胞死亡的类型（细胞凋亡或是坏死），通过检测M30和M65的含量，估计凋亡和坏死细胞死亡的相对数量[13]。Vatsalya等[14]研究证实，与谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）和AST：ALT比值相比，血清K18水平与肝细胞死亡数量和肝脏疾病严重程度之间的相关性更强。死亡受体（death receptor，DRs）5是一种细胞表面受体，可介导肿瘤坏死相关的凋亡信号，Bozza等[15]的研究表明，K8/K18可负向调控DR5蛋白的稳定性和表达，从而限制肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）诱导的细胞凋亡。
3.1 诊断和鉴别肿瘤K18通常在单层腺上皮及假复层上皮中表达，可用于诊断来源于单层腺上皮、间皮、移行上皮的肿瘤，目前也在一些鳞状细胞癌中发现K18的高表达。目前，K18已在多个系统的肿瘤中作为诊断性标志物得到应用，能够有效帮助诊断、鉴别恶性肿瘤和良性肿瘤。
3.1.1 消化系统肿瘤 消化系统包括消化管和消化腺，消化管连接多种消化器官，均有发生肿瘤的可能。研究报道，原发性胃癌患者血清K18水平显著高于正常健康体检者，K18水平能够作为胃癌的诊断性标志物[16]。Chen等[17]分析450例胃腺癌组织样本中K18的表达水平，也发现肿瘤组织中K18的表达水平显著升高。宋丽娜等[18]研究显示，K18在大肠癌组织的表达量高于癌旁组织，且主要表达在细胞质。Kilic-Baygutalp等[19]发现，晚期食管鳞状细胞癌组血清K18水平显著高于健康对照组。
大多数肝细胞癌发生在慢性肝病的环境中，如肝炎病毒感染或酗酒导致肝硬化和肝脏受损的患者中[20]。K18在肝细胞癌中过表达，可通过蛋白激酶B（Akt）、Raf等信号蛋白以及应激活化蛋白激酶，改变细胞增殖和迁移信号通路，参与调控肝细胞癌的发展，被认为是肝细胞癌的肿瘤标志物。Elalfy等[21]的研究中，肝癌患者M30水平显著高于健康受试者或肝硬化代偿患者。人类肝细胞癌株可分为两种基因表达亚型S1和S2型，Golob-Schwarzl等[22]的研究中，K8/K18比值较高的肝细胞癌细胞株在S1型中更常见，S1型肿瘤具有TGF-β/WNT和核β-CATENIN激活，上皮-间充质转化（epithelial–mesenchymal transition，EMT）的分子特征，术后早期肿瘤复发率高。
3.1.2 呼吸系统肿瘤K18在肺腺癌、腺鳞癌、小细胞癌及大细胞癌中均有较高的阳性表达率，在鳞癌中无阳性表达。Zhang等[23]在101/129例（78.3%）肺癌患者检测到K18的高表达，主要表达在癌细胞胞浆中。K18的表达与非小细胞肺癌临床分期、淋巴结转移、病理阳性淋巴结数及复发转移显著相关，可作为非小细胞肺癌的组织病理学诊断标志物，且是非小细胞肺癌进展和预后的潜在预测因子。王钧[24]的研究也证实，在非小细胞肺癌中K18呈高表达，其表达水平与疾病总生存期和疾病无进展生存期相关。Nagashio等[25]报道，K18在肺大细胞神经内分泌癌中的表达高于小细胞肺癌，可作为鉴别两种癌症的诊断指标。
3.1.3 生殖、泌尿系统肿瘤 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，在原发性乳腺癌中，与基础亚型和正常 亚 型 相 比，K8/K18基 因 在LumA、LumB和HER2+肿瘤中表达显著升高[24]。张青等[26]通过慢病毒介导K18基因沉默，可时间依赖性地抑制人乳腺癌BT549细胞的生长增殖，可促进乳腺癌细胞的凋亡。卵巢癌也是女性常见的恶性肿瘤，72例卵巢浆液性癌组织中K18的阳性表达率达100%，K18表达水平低者易出现淋巴结转移，在一定程度上提示了患者预后不良[27]。
宋继文等[28]报道膀胱移行细胞癌患者尿中K18水平明显高于非移行细胞肿瘤和泌尿系良性疾病患者，K18可作为膀胱移行细胞癌术前鉴别判断良恶性肿瘤的重要标志物。郑睿等[29]对肌层浸润性膀胱癌与非肌层浸润性膀胱癌比较发现，随着肌层浸润性膀胱癌进展，K18的表达水平逐渐增高。Nanou等[30]的研究中，有循环肿瘤细胞存在的去势难治性前列腺癌患者的血浆K18水平要高于健康人。3.1.4其他肿瘤Sproll等[31]通过检测来自头颈部鳞状细胞癌的播散性肿瘤细胞的基因组改变分析肿瘤细胞的淋巴和血液播散途径，在淋巴和骨髓均发现K18和上皮细胞黏附分子的染色体畸变。Zhou等[32]研究不同类型皮肤附件肿瘤角蛋白表达水平的差异，K18在鳞状细胞癌的表达水平要高于基底细胞癌，在汗腺肿瘤的表达水平要高于毛囊肿瘤。
3.2 判断肿瘤分期和预后 许多研究证实，K18的表达与肿瘤的分期及预后相关。K18表达水平的增加预示着肿瘤分期的提高，预后较差。Wang等[35]发现，K18在胃癌组织中的表达率（82.5%）明显高于癌旁组织（35.7%），胃癌患者血清中K18表达增加提示预后不良，K18高表达被确定为影响胃癌患者无病生存期的独立预后危险因素。Peduk等[34]研究认为，胃癌患者血清K18水平与病理N分期呈正相关。也有研究认为K18可作为判断胃癌预后和术后复发的参考指标[16]。Backen等[35]对接受西地尼布进行治疗的晚期胆道癌患者的K18进行检测，K18的增加与患者总生存期较低相关。张超等[36]研究发现，K18在不同临床危险度分级的前列腺癌中表达不同，随着临床危险度的增加，其表达水平呈现降低的趋势，可作为评估前列腺癌临床危险度分级的指标及判断前列腺癌病情进展到去势抵抗型前列腺癌阶段（castration-resistant pros-tate cancer，CRPC）所需时间的重要参考指标之一。随着K18表达水平的下调，进展到CRPC的时间缩短。宋继文等[28]对膀胱移行细胞癌患者术后动态观察，治疗有效的K18表达水平较治疗前明显下降，而复发、转移的患者K18表达水平则上升。
K18在对鳞状细胞癌分期和预后的作用也已有多项研究报道。Kilic-Baygutalp等[19]证实血清K18水平与食管鳞状细胞癌的肿瘤分期、疾病分期呈正相关。Safadi等[37]进行角蛋白与口腔和口咽鳞状细胞癌的临床和组织病理学预后的相关性分析发现，升高的K18与更高的分期和侵袭深度相关，且与局部复发相关。王艳婷等[38]发现，血清K18水平可作为喉癌预后和疾病监测的生物标志物，中低分化程度、肿瘤分级较高、临床分期较高的患者血清K18浓度显著高于高分化程度、肿瘤分级较低、临床分期较低的患者血清K18浓度，且5年期生存率高K18组显著低于低K18组。
然而，K18在乳腺癌预后和分期中的作用还存在一定争议。Ha等[39]研究认为，K18的缺失，促进了移植瘤的体内生长和体外侵袭性，可能是乳腺癌预后不良的一个指标。王畅[40]研究显示，K18在癌旁组织的表达高于乳腺癌肿瘤组织，且K18的低表达与病理分期具有相关性，K18的低表达患者总生存期和无病生存期较K18的高表达患者均降低。而Yang等[41]对9项共4 857例乳腺癌相关研究进行Meta分析，表明K18可作为一种新的生物标志物来预测乳腺癌的临床病理特征和预后，K18的高水平表达与乳腺癌患者的总生存期显著相关，高表达K18与晚期乳腺癌的肿瘤大小、肿瘤分期和肿瘤分级呈正相关。差异可能与检测的是血清中的K18还是癌症组织中的K18水平有关。血清中K18的高表达与乳腺癌患者预后不良显著相关，而组织中K18的高表达与乳腺癌患者预后良好显著相关。血清中K18的水平反映了死亡癌细胞释放的CK18，而组织中K18的表达水平通常反映了组织的分化状态。
3.3 预测肿瘤转移风险 肿瘤转移是癌症相关患者死亡的主要原因，因此，预测肿瘤转移风险对癌症患者十分重要。Elalfy等[21]研究显示，更高的M30片段水平与肝细胞癌血管浸润相关，血清M30片段水平超过304.5 U/L是肝细胞癌血管浸润的独立预测因子，应选择肿瘤边缘较宽的肝切除术来根治可疑肝癌。肺癌患者血清中K18水平升高对于判断肺癌的转移具有重要的指导意义，K18高表达与淋巴结转移、复发转移正相关[23]。食道癌中，有癌转移的患者血清K18水平明显高于无癌转移的患者[19]，在活检时评估患者血清K18水平可能有助于预测食管鳞状细胞癌患者的转移风险，而无需使用影像学技术。沉默K18基因可抑制乳腺癌细胞的运动和侵袭能力，K18可能通过EMT参与了乳腺癌细胞的侵袭运动过程，提示K18在乳腺癌细胞的侵袭转移过程中发挥一定作用[26]。
3.4 评价肿瘤治疗疗效 一些研究证实，可通过检测血清中K18水平或M30、M60来分析患者治疗的有效性。Nagel等[42]探讨M30和M65在预测晚期胃癌治疗反应和生存中的作用，晚期胃癌患者化疗期间M30水平显著降低，而有癌转移的患者治疗后无明显下降，治疗失败的患者第14天的M30水平显著升高，第14天的M30被确定为治疗反应的独立预测因子。同样，M65水平也与无效治疗和无进展生存期相关。Yu等[43]对乳腺癌相关的软脑膜转移患者脑脊液源性循环肿瘤细胞（cerebrospinal fluidderived circulating tumor cells，CSFTCs）中K18表达水平进行监测，随着鞘内治疗进行，CSFTCs数量和K18免疫荧光强度逐渐降低。
但Fazilat-Panah等[44]评估晚期乳腺癌患者化疗期间血清中K18水平的变化，化疗前后M30和M65的水平变化无统计学意义，M30/M65水平与新辅助化疗的病理反应无相关性。林洁等[27]的研究也认为K18表达与卵巢癌患者化疗效果、总生存期及无病生存期无关。
综上所述，K18作为细胞骨架的结构蛋白，能维持组织的完整性，调节细胞分裂、迁移、分化和凋亡，在肿瘤的诊断和分型中起到重要作用，可帮助临床诊断和鉴别肿瘤，判断肿瘤分期，预测肿瘤转移的风险，评价肿瘤治疗的效果，评估肿瘤患者的预后，但在一些个别癌症如乳腺癌等的作用还有一定争议，有待进一步研究。
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