肿瘤相关糖蛋白72在胃癌组织和外周血中的表达及临床意义
何秋凤， 李 琳， 张彩丽， 朱元民
1.北京大学航天临床医学院 航天中心医院消化内科，北京 100049；
2.青岛大学附属医院输血科
2020年全球统计数据显示，胃癌在常见恶性肿瘤中位居第五，且位于肿瘤相关死亡率的第四位[1]。寻找有效、特异的胃癌分子标志物对于疾病诊断、治疗、预后判断具有重要意义。
肿瘤相关糖蛋白72(tumor-associated glycoprotein 72，TAG-72)是一种具有黏膜特性的膜结合高分子糖蛋白复合物[2]。该分子在1981年首次被发现，后证实在多种肿瘤组织中高表达。TAG-72可分泌至外周血，称为糖类抗原724(carbohydrate antigen 724，CA724)，是临床上常见的上皮肿瘤标志物[3-5]。基于中国人群的荟萃分析显示，相比CEA、CA199等其他肿瘤标志物，血清CA724是诊断胃癌特异性和敏感性最高的分子标志物，其敏感性和特异性分别为50%和80%[6]。目前TAG-72在胃癌中的研究主要集中于CA724在胃癌诊断中的应用，尚缺乏组织中TAG-72表达情况及临床意义的研究以及二者相关性的分析。
本研究通过免疫组化方法检测胃癌组织中TAG-72的表达情况，旨在探究组织TAG-72与胃癌患者临床病理特征及生存预后之间的关系，并分析胃癌组织及术前外周血中TAG-72在表达水平、临床意义方面的相关性及差异性。
1.1 组织标本选用1996年1月至2007年1月胃癌手术切除标本149例。入选标准为：患者在手术前未经过任何化疗或放疗；
所有标本经病理检查证实。胃癌的分期采用AJCC癌症分期手册第7版[7]。患者男97例，女52例，平均年龄60岁(51～67.5岁)。TNM分期包括Ⅰ期13例，Ⅱ期24例，Ⅲ期92例，Ⅳ期20例；
癌细胞侵袭深度包括T16例，T218例，T319例，T4106例；
无淋巴结转移28例，淋巴结转移包括N118例，N237例，N366例；
远处转移17例；
分化类型包括低分化113例，中分化29例，高分化7例。其中，71例胃癌标本检测有术前外周血CA724值3.16 U/ml(1.35～8.65 U/ml)。本研究通过我院伦理委员会批准，所有研究对象均知情同意。
1.2 方法
1.2.1 胃癌组织TAG-72检测：免疫组化技术采用EnVision二步法。组织切片脱蜡止水，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，EDTA9.0修复液高压修复3 min，质量浓度为100 g/L的羊血清封闭液室温封闭1.5 h，滴加一抗兔抗人多克隆抗体(abcam，ab16838)、4 ℃孵育过夜(>14 h)。滴加二抗(Dako，K5007)，室温孵育30 min后DAB显色，苏木素复染，返蓝，脱水，透明，树脂封片。染色评分根据染色强度分为四级：0，阴性；
1，弱阳性；
2，中等强度；
3，强阳性。阳性面积分为五级：0，无阳性染色；
1，阳性面积<10%；
2，阳性面积10%～20%；
3，阳性面积20%～50%；
4，阳性面积>50%。染色强度与染色面积的评分综合判定标准如下：-，无细胞着色；
±，<10%的细胞着色；
+，10%～20%的细胞呈弱阳性至中度着色；
++，10%～20%的细胞呈中等强度染色或20%～50%的细胞弱阳性着色；
+++，20%～50%的细胞呈中等强度以上着色，或>50%的细胞呈阳性着色。根据评判结果将TAG-72表达分为阴性表达(-，±)及阳性表达(+，++，+++)两组。
1.2.2 术前血清CA724检测：采集研究对象空腹静脉血3 ml，离心(4 000 r/min)5 min后，取上层血清，采用罗氏Elecsys 602型电化学发光免疫分析仪，检测受试者术前血清肿瘤标志物CA724，试剂由罗氏公司配套提供，按说明书操作。CA724正常值参考范围为0～6.9 U/ml，超过参考值为阳性。
1.3 统计学方法采用SPSS 25.0软件和Graph-Pad Prism 8.0(GraphPad，San Diego，CA)软件进行统计学分析。TAG-72表达与临床病理特征关系采用χ2检验。采用Kaplan-Meier法和Log-Rank法评估TAG-72阳性表达和阴性表达患者的生存率；
采用Cox回归分析评估多个变量对生存的影响；
分类变量的相关性分析采用Spearman相关。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 TAG-72在胃癌组织、癌旁正常组织中的表达各组织标本基本情况如表1所示。采用免疫组化法检测TAG-72在胃癌中的表达。TAG-72在胃癌组织中呈棕黄色染色，定位于胞浆和/或胞膜(见图1)。TAG-72在胃癌组织中的阳性率为53.02%(79/149)，高于癌旁正常组织的阳性率12.94%(11/85)，差异有统计学意义(P<0.05)。此外，TAG-72在20例肠化组织中有19例表达阳性，阳性率95.00%(见图2)。
注：A：癌旁正常组织(阴性)；
B：胃癌组织(阴性)；
C：胃癌组织(++)；
D：胃癌组织(+++)；
E：肠化组织(++)；
F：肠化组织(+++)。
表1 各组织标本基本情况
续表1
2.2 TAG-72表达与胃癌患者临床病理特征关系分析149例胃癌患者组织中TAG-72表达与临床病理参数间的相关性，结果显示，TAG-72表达与性别、年龄、分化程度、TNM分期、癌细胞浸润深度、淋巴转移、远处转移均无相关性(P>0.05)(见表2)。
表2 TAG-72表达与胃癌患者临床病理特征关系[例数(%)]
2.3 TAG-72表达与生存预后密切相关生存分析显示,TAG-72表达阳性组总体生存率显著低于阴性组，差异有统计学意义(Log-Rankχ2=5.380，P=0.02)(见图3A)；
TAG-72表达阳性组的5年生存率也显著低于阴性组，差异有统计学意义(Log-Rankχ2=7.058，P=0.008)(见图3B)。Cox回归分析显示，TAG-72表达、年龄、TNM分期、远处转移是胃癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)(见表3)。
注：A：总体生存曲线；
B：5年生存曲线。
表3 胃癌患者死亡率的多因素分析
2.4 胃癌患者组织TAG-72表达与术前外周血CA724相关性149例胃癌标本中有71例进行术前外周血CA724检测，采用Spearman相关分析发现胃癌患者组织中TAG-72表达与术前外周血中CA724表达呈正相关，相关系数为0.314(P=0.008)，为弱相关。
2.5 术前外周血CA724与胃癌患者预后无关分别分析71例胃癌患者组织和术前外周血中TAG-72表达与预后的相关性，结果显示，胃癌组织TAG-72表达阳性组与阴性组患者5年生存率有显著差异(Log-Rankχ2=5.638，P=0.018)(见图4A)；
而术前外周血CA724阳性组与阴性组间5年生存率差异无统计学意义(P=0.416)(见图4B)。进一步联合组织和血清TAG-72判断胃癌患者5年生存率，结果显示,组织-/血清-双阴性患者生存最优，而组织+/血清-患者预后最差(见图4C)。
注：A：5年生存曲线(TAG-72)；
B：5年生存曲线(CA724)；
C：5年生存曲线(TAG-72联合CA724)。
TAG-72在多种肿瘤组织中高表达，而正常人体细胞中缺乏表达，其“肿瘤特异性”备受关注，已作为肿瘤识别靶点应用于放射免疫等领域，可显著改善患者预后[8]。现已开发出针对TAG-72的B72.3抗体和CC49抗体用于分子检测及治疗[9-10]。在胃癌中，目前针对TAG-72的研究多关注外周血CA724在胃癌诊断中的价值和应用[11-13]。近期有研究发现，胃酸中高水平TAG-72是胃癌预后的独立危险因素[14]。而TAG-72在胃癌组织中的表达、功能以及与患者生存预后之间的关系尚未明确。本研究对胃癌组织中TAG-72表达情况及其临床意义进行研究，为TAG-72作为胃癌肿瘤靶点提供数据支持。
本研究发现TAG-72在胃癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织，与刘栋才等[4]研究结果一致。TAG-72在胃癌中普遍高表达这一特性提示其或可成为其他药物、工程细胞等识别胃癌细胞的潜在靶点。胃癌通常是由多阶段分子改变积累形成的复杂过程，从非萎缩性胃炎到萎缩性胃炎、肠上皮化生、不典型增生，最后发展为浸润性癌，其中肠上皮化生被认为是胃癌的重要癌前病变[15-16]。本研究发现TAG-72在肠化组织中的表达率高达95%，提示TAG-72可能参与肠型胃癌早期发生过程，或可成为胃黏膜肠上皮化生的标志物。但本研究肠化组织样本量较小，尚需要进一步功能研究阐释TAG-72与肠化之间的关系。
我们的分析显示TAG-72表达与临床病理学参数间并无相关性。低分化、TNM分期Ⅲ+Ⅳ、区域淋巴结转移及远处器官转移患者其TAG-72表达阳性率高于中-高分化、TNM分期Ⅰ+Ⅱ、无区域淋巴结转移及无远处器官转移患者，但差异无统计学意义，提示TAG-72可能通过其他肿瘤生物学特征影响胃癌患者生存预后。既往研究[17]表明，肿瘤细胞表面的大分子糖蛋白可以和免疫细胞表面的凝集素结合或抑制效应T细胞功能参与肿瘤免疫逃逸。TAG-72作为膜表面糖蛋白分子，免疫逃逸可能是TAG-72影响胃癌发生发展的效应途径之一，有待进一步功能研究明确。而大分子糖蛋白由于其糖链紧密包裹蛋白分子，难以实现蛋白敲低和过表达。受限于实验技术，针对TAG-72的功能研究相对缺乏，随着实验技术发展，TAG-72在胃癌中的功能机制有望突破。
本研究证实TAG-72阳性表达的胃癌患者总体生存率和5年生存率低于阴性表达患者，高表达TAG-72是胃癌患者预后不良的独立危险因素。这与一项在结直肠腺癌中的研究结论相同[3]，进一步提示TAG-72可能具有影响肿瘤患者预后的重要分子生物学功能。
外周血CA724是目前胃癌筛查常用的肿瘤标志物，但其特异性和敏感性并不高，不能充分满足临床要求[6]。胃癌组织细胞表达和分泌TAG-72，进入外周血后称为CA724。本研究分析了术前CA724和肿瘤组织中TAG-72表达间的相关性，发现二者存在正相关，但相关程度弱，相关系数仅为0.314，这或能部分解释TAG-72在胃癌组织中高表达而术前CA724用于胃癌诊断则敏感性不足。本研究还发现，胃癌患者组织中TAG-72表达与预后显著相关，而术前CA724与患者预后无关。该结果提示胃癌患者术前CA724检测与组织TAG72表达具有不同临床含义，前者更具诊断价值，后者则对预后判断更具意义。
综上所述，TAG-72在胃癌组织和肠化组织中高表达，是胃癌患者不良预后的独立危险因素，有望作为胃癌潜在的治疗靶标和预后判断指标。术前外周血CA724与组织TAG-72在表达水平上呈弱相关，术前外周血CA724在预后判断方面价值有限。TAG-72在胃癌中的机制尚未阐明，免疫逃逸可能是效应途径之一，随着实验技术的发展，其在胃癌中的分子机制有望实现突破。
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