滋阴补脾法对人结肠癌裸鼠肿瘤标志物的影响
李静，武如通，朱汉平
[1.广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院）脾胃病科，广东广州510095；
2.广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院）肿瘤病科，广东广州510095；
3.广州医科大学附属第一医院中医科，广东广州510120]
结肠癌是消化道常见恶性肿瘤之一。近年来，结肠癌发病率呈现上升趋势，由于结肠癌早期症状不明显，因此，大部分患者诊断时结肠癌已处于中晚期，手术治疗效果不佳[1]。随着对结肠癌的不断深入研究，对结肠癌肿瘤细胞生化有了更加明确的认知[2]。CD133、CD166均为肿瘤干细胞标志物，参与机体多种病理生理过程[3]。p53作为抑制细胞生长的基因调控靶点，可以诱导细胞凋亡，p53基因的突变，是导致多种肿瘤发生的重要因素[4-6]。中医药在治疗恶性肿瘤方面，不仅能够获得良好疗效，对免疫功能和生活质量也有一定的提高。既往有学者对90例大肠癌患者给予滋阴补脾方联合化疗进行干预，结果发现，滋阴补脾方联合化疗可提高患者治疗有效率及Karnofsky功能状态（KPS）评分，改善患者免疫功能，减少不良反应，改善预后[7]。本科室对收治的肺癌、乳腺癌、肝癌及结肠癌化疗患者，给予滋阴补脾法干预，发现化疗联合滋阴补脾法治疗化疗早期患者疗效较好，其中，结肠癌患者改善较为明显。但是，对于滋阴补脾法抗结肠癌的作用机制尚不明确，因此，本研究为进一步探究滋阴补脾法对结肠癌的治疗作用及机制，观察了其对结肠癌裸鼠模型肿瘤标志物表达的影响，现将研究结果报道如下。
1.1 实验动物35只SPF级6～8周龄雄性SD裸鼠，体质量15～20 g，由广州医科大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK（粤）2021-0014。实验全程于广州医科大学实验动物中心完成。本次实验符合《实验动物管理条例》规定。
1.2 药物、试剂与仪器滋阴补脾中药复方由太子参20 g、黄芪15 g、山药15 g、茯苓10 g、白花蛇舌草30 g组成，其配方颗粒由广东一方制药有限公司生产；
氟尿嘧啶注射液（上海旭东海普药业有限公司生产，批号：国药准字H31020593）。CD133抗体、CD166抗体、p53抗体（美国Abcam公司）。显微镜（天津微仪光学仪器，型号：BM19A-320M）。
1.3 COLO-320细胞悬液制备人结肠腺癌细胞COLO-320，购自广州吉妮欧生物科技有限公司。将COLO-320细胞以RPMI 1640完全培养基（含10%胎牛血清）传代培养。取对数生长期细胞制成COLO-320细胞悬液，密度为1×108个/mL。
1.4 建模、分组与给药取COLO-320细胞悬液0.1 mL接种于裸鼠背部皮下构建结肠癌移植瘤模型。接种过程中有2只裸鼠死亡，1只接种失败。接种结肠癌细胞株后成瘤时间为12 d左右。最终选取移植瘤平均直径为5 mm左右的裸鼠32只，随机分为4组，即空白组、化疗组、中药组、联合组，每组8只。各组裸鼠建模成功后首次用药时间记为第1天。空白组：上午、下午分别给予腹腔注射、灌胃生理盐水；
化疗组：上午腹腔注射氟尿嘧啶0.5 g·kg-1，下午灌注生理盐水；
中药组：上午给予腹腔注射生理盐水，下午给予滋阴补脾中药复方颗粒混悬液20 g·kg-1灌胃；
联合组：上午给予腹腔注射氟尿嘧啶0.5 g·kg-1，下午给予滋阴补脾中药复方颗粒混悬液汤剂20 g·kg-1灌胃。连续干预7 d，至第14天（即治疗后第7天）处死动物收集标本（因药物疗效有滞后性，因此第14天处死实验裸鼠）。
1.5 观察指标与方法
1.5.1 肿瘤生长情况给药期间，采用活体成像仪测量裸鼠移植瘤最大径（a）及最小径（b），2 d测量1次，给药期间裸鼠无死亡。最后32只裸鼠于治疗后第7天处死，解剖出移植瘤称质量。根据移植瘤体积[V=1/2（a×b2）]的均数绘制肿瘤生长曲线，体积抑制率=（空白组瘤体积-实验组瘤体积）/空白组瘤体积×100%。计算抑瘤率，抑瘤率=（显效只数+有效只数）/总只数×100%。显效：肿瘤消失或者肿瘤直径减小超过80%；
有效：肿瘤直径减小40%～80%；
无效：肿瘤直径无显著减小或者肿瘤直径呈现增长。
1.5.2 Western Blot法检测治疗前后结肠癌组织中CD133、CD166、p53蛋白表达取结肠癌组织，剪碎后裂解提取组织蛋白，用BCA测定其浓度，分装后，-20℃保存。将蛋白溶液和缓冲溶液按照4∶1的体积比例混匀，然后煮沸使其变性，电泳，将蛋白转移到PVDF膜上，脱脂奶粉封闭，PBS洗涤3次后分别加入CD133、CD166、p53等一抗（1∶100体积比稀释）4℃过夜孵育。回温后PBS洗涤3次，加入生物素标记的二抗（1∶500体积比稀释），室温孵育60 min，PBS洗涤3次，用DBA试剂盒显色，曝光，应用Image Pro Plus 6.0（Media Cybernetics）软件分析结果。结果以目的蛋白与内参蛋白（GAPDH）灰度值比值表示。
1.6 统计方法采用SPSS 21.0软件对获得的数据进行处理分析。其中：计数资料采用χ2检验，以n/%表示；
计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较用方差分析，不同时间点多组比较采用重复测量方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 各组结肠癌裸鼠瘤体直径、质量比较表1、图1结果显示：治疗后第7天，化疗组、中药组以及联合组结肠癌裸鼠瘤体最小径、最大径及瘤体质量较空白组均显著下降（P＜0.05），化疗组和联合组的瘤体最小径、最大径及瘤体质量显著低于中药组（P＜0.05），联合组的瘤体最小径、最大径及瘤体质量则显著低于化疗组（P＜0.05）。
表1 各组结肠癌裸鼠瘤体直径、质量比较Table 1 Comparison of tumor diameter and mass among various groups of nude mice bearing colon cancer （±s）
表1 各组结肠癌裸鼠瘤体直径、质量比较Table 1 Comparison of tumor diameter and mass among various groups of nude mice bearing colon cancer （±s）
注：①P＜0.05，与空白组比较；
②P＜0.05，与化疗组比较；
③P＜0.05，与中药组比较
组别空白组化疗组中药组联合组鼠数/只8 8 8 8瘤体最小径/mm 6.77±0.35 2.19±0.16①3.22±0.18①②1.09±0.09①②③瘤体最大径/mm 8.37±2.19 3.73±1.01①4.93±1.37①②3.01±0.86①②③瘤体质量/g 18.43±4.10 6.92±2.09①12.13±2.49①②4.01±1.08①②③
图1 各组结肠癌裸鼠治疗后第7天瘤体图片Figure 1 Image of tumors in each group of nude mice bearing colon cancer day 7 after treatment
2.2 各组结肠癌裸鼠肿瘤生长情况比较表2、图2结果显示：治疗前，各组结肠癌裸鼠肿瘤体积比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；
从治疗第2天开始，空白组裸鼠肿瘤体积不断增加，化疗组、中药组以及联合组结肠癌裸鼠肿瘤体积逐渐下降，与空白组同期比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。从治疗后第1天开始，联合组、化疗组结肠癌裸鼠肿瘤体积明显低于中药组（P＜0.05）。从治疗后第3天开始，联合组结肠癌裸鼠肿瘤体积明显低于化疗组、中药组（P＜0.05）。
图2 各组结肠癌裸鼠肿瘤生长曲线Figure 2 Tumor growth curve of each group of nude mice bearing colon cancer
表2 各组结肠癌裸鼠肿瘤体积比较Table 2 Comparison of tumor volume among various groups of nude mice bearing colon cancer（±s，mm3）
表2 各组结肠癌裸鼠肿瘤体积比较Table 2 Comparison of tumor volume among various groups of nude mice bearing colon cancer（±s，mm3）
注：①P＜0.05，与空白组比较；
②P＜0.05，与化疗组比较；
③P＜0.05，与中药组比较
组别空白组化疗组中药组联合组鼠数/只8 8 8 8治疗前62.7±10.18 62.4±9.87 62.1±9.96 62.6±10.03治疗第2天70.17±11.17 54.09±9.72①56.47±8.37①52.02±9.26①治疗第4天79.42±13.21 45.28±7.93①48.08±7.93①45.09±7.63①治疗第6天90.63±15.09 37.14±6.05①40.18±5.98①35.41±5.09①治疗后第1天106.36±17.12 26.09±4.79①35.52±5.11①②25.16±3.10①②治疗后第3天124.29±18.06 18.57±3.47①28.19±4.61①②13.09±2.13①②③治疗后第5天136.08±19.56 10.36±2.81①24.31±3.97①②6.27±1.53①②③治疗后第7天144.15±20.37 7.27±1.38①20.16±3.09①②3.08±1.07①②③
2.3 各组抑瘤率比较表3结果显示：治疗后第7天，空白组、化疗组、中药组、联合组抑瘤率分别为0.00%、87.50%、75.00%、100.00%，各组抑瘤率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。
表3 各组抑瘤率比较Table 3 Comparison of tumor suppression rates among various groups
2.4 各组结肠癌裸鼠肿瘤组织CD133、CD166、p53蛋白表达比较表4、图3结果显示，治疗前，各组结肠癌裸鼠肿瘤组织CD133、CD166、p53蛋白表达水平均呈高表达，组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；
治疗后第7天，空白组结肠癌裸鼠肿瘤组织CD133、CD166、p53蛋白表达水平均高于治疗前（P＜0.05），化疗组、中药组以及联合组结肠癌裸鼠肿瘤组织CD133、CD166、p53蛋白表达水平均低于治疗前，并显著低于空白组，差异均有统计学意义（P＜0.05），且联合组的降低作用优于化疗组、中药组（P＜0.05）。
图3 各组结肠癌裸鼠治疗后第7天肿瘤组织CD133、CD166、p53蛋白Western Blot电泳图Figure 3 Western Blot electrophotogram of CD133，CD166 and p53 proteins in tumor tissue in each group of nude mice bearing colon cancer on 7th day after treatment
表4 各组结肠癌裸鼠肿瘤组织CD133、CD166、p53蛋白表达比较Table 4 Comparison of protein expressions of CD133，CD166 and p53 in tumor tissue among various groups of nude mice bearing colon cancer （±s）
表4 各组结肠癌裸鼠肿瘤组织CD133、CD166、p53蛋白表达比较Table 4 Comparison of protein expressions of CD133，CD166 and p53 in tumor tissue among various groups of nude mice bearing colon cancer （±s）
注：①P＜0.05，与同组治疗前比较；
②P＜0.05，与空白组治疗后第7天比较；
③P＜0.05，与化疗组治疗后第7天比较；
④P＜0.05，与中药组治疗后第7天比较
组别空白组化疗组中药组联合组鼠数/只8 8 8 8 CD133蛋白相对表达量治疗前1.15±0.16 1.18±0.17 1.13±0.15 1.19±0.18治疗后第7天1.39±0.21①0.74±0.12①②0.83±0.14①②0.52±0.08①②③④CD166蛋白相对表达量治疗前1.26±0.14 1.23±0.16 1.28±0.17 1.24±0.13治疗后第7天1.47±0.23 0.89±0.14①②0.85±0.11①②0.59±0.06①②③④p53蛋白相对表达量治疗前1.39±0.18 1.41±0.19 1.37±0.16 1.42±0.15治疗后第7天1.58±0.24 1.11±0.09①②0.86±0.15①②③0.64±0.13①②③④
氟尿嘧啶等传统化疗方案的毒副反应是影响化疗实施的主要原因。滋阴补脾中药复方是本科室临床辅助治疗胃肠道肿瘤的经验方。处方中以扶正益气之药黄芪、太子参、山药等为君，以攻伐抗癌之药白花蛇舌草为臣，佐以茯苓以助消癌，全方合用，共奏扶助正气、攻伐癌肿之功效。本研究结果显示，以人结肠癌裸鼠移植瘤模型为研究对象，滋阴补脾法可以对结肠癌细胞生长起到抑制作用，与化疗药物联用可以明显抑制肿瘤生长，降低肿瘤标志物表达，有助于结肠癌的化疗药物治疗。
近年来，对癌干细胞的研究一直是科研的热点，包括癌干细胞生物学鉴定、癌干细胞的发生发展、癌干细胞标志物以及癌干细胞对肿瘤治疗的影响等[8]。癌干细胞具有一些特殊的表面标志物（marker），如CD133、CD44、CD166等，不同的肿瘤癌干细胞表面marker不同。CD133和CD166也被公认为识别结肠癌癌干细胞的表面marker[9-11]。有研究指出，结肠癌患者死亡率高、易转移、易复发的主要原因与癌干细胞相关，通过CD133、CD166表达水平，可以初步判断癌干细胞的分化能力，评估结肠癌患者预后[12-14]。p53基因作为抑癌基因，主要由393个氨基酸组成，p53基因在细胞周期的调控、细胞凋亡、DNA修复、细胞分化等重要生物学功能有关，p53过表达被认为与肿瘤的转移复发以及不良预后关系密切[15-17]。本研究结果显示，从开始治疗至治疗后第7天，空白组结肠癌裸鼠瘤体最大径、最小径，瘤体体积及瘤体质量均呈现增长，且肿瘤组织CD133、CD166以及p53蛋白表达水平呈高表达；
与空白组比较，化疗组、中药组以及联合组结肠癌裸鼠瘤体最大径、最小径，瘤体体积及瘤体质量均下降，抑瘤率增加，肿瘤组织CD133、CD166以及p53蛋白表达水平亦明显下降，且联合组作用效果明显优于化疗组、中药组。根据结果可以看出，仅给予生理盐水对肿瘤生长无抑制作用，停止生理盐水后肿瘤继续生长，化疗组在给予氟尿嘧啶干预后肿瘤停止生长且出现肿瘤体积变小的现象，表明肿瘤细胞对化疗药物敏感，化疗效果显著；
中药组结肠癌裸鼠给予滋阴补脾中药复方治疗后肿瘤体积亦被抑制，但是较化疗组抑制效果稍显不足；
联合组疗效是最显著的，表明化疗药物和滋阴补脾法中药联合使用，治疗效果更佳。
综上所述，滋阴补脾法可明显抑制结肠癌裸鼠肿瘤细胞生长，下调肿瘤标志物表达，与化疗药物联用抑制肿瘤生长作用更优，提示其有助于结肠癌的化疗药物治疗，因此可考虑进一步应用于临床研究。但是由于纳入研究裸鼠数量有限，且研究周期较短，对药物敏感度特异性的研究尚不足，因此有待进一步评估此结论。
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