提高黔淫羊藿的质量标准研究
祝清灿，孙宜春，罗 倩，罗文平，刘 凯，李慧馨，王 杏，段 丽
国药集团同济堂(贵州)制药有限公司，贵阳 550026
黔淫羊藿为小蘗科植物粗毛淫羊藿EpimediumacuminatumFranch、天平山淫羊藿EpimediummyrianthumSteam、毡毛淫羊藿EpimediumcoactumH.R.Liang et W.M.Yan及黔岭淫羊藿EpimediumleptorrhizumStearn的干燥地上部分，无臭，味微苦，夏秋二季茎叶茂盛时采收，为《贵州省中药材、民族药材质量标准》收录的贵州省少数民族用药[1]，主要分布于四川、贵州、云南、湖北、广西等省区[2-4]，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效[5-7]，临床主要用于治疗阳痿遗精、筋骨痿软、风湿痹痛、麻木拘挛等症[8]。研究表明，淫羊藿属植物中主要含黄酮、木脂素、生物碱、挥发油、苯酚苷、多糖及微量元素等成分[9-10]，具有补肝肾、强筋骨、祛风湿、抗衰老、提高免疫力、抑制肿瘤、抑制骨吸收等药理作用[11-14]。黔淫羊藿现行标准项下仅收载性状、薄层鉴别、含量测定等检测项目。本研究增加了显微鉴别、水分和灰分、浸出物检查项目，改进了薄层鉴别方法，用高效液相色谱法进行含量测定，为质量标准修订提供参考。
1.1 仪器
Vanquish型高效液相色谱仪(在线脱气，六元泵，二级管阵列检测器，工作站，赛默飞世尔科技有限公司)；
ME204TE/02型电子天平(梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司)；
SB25-12DTS型数控超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；
Goodsee-Ⅱ型紫外分析仪(上海科哲生化科技有限公司)；
202-2AB型电热鼓风干燥箱(上海路达实验仪器有限公司)。色谱柱：太玮科技JADE-PAK ODS-AQ(250 mm×4.6 mm，5 μm)；
安捷伦 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；
菲罗门Superlu C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；
依利特HypersilBDS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；
迪马Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。
1.2 试药
朝藿定C(批号110738-201905)，淫羊藿苷(批号110731-201518，含量94.2%)均购自中国食品药品检定研究院。硅胶G薄层板(青岛海洋化工有限公司)；
乙腈为色谱纯，水为自制纯化水，其他试剂均为分析纯。
粗毛淫羊藿、天平山淫羊藿、毡毛淫羊藿、黔岭淫羊藿原植物及样品均由国药集团同济堂(贵州)制药有限公司种植部提供，且经贵州中医药大学药学院何顺志教授鉴定，分别为小蘗科Berberidaceae淫羊藿属Epimedium植物粗毛淫羊藿EpimediumacuminatumFranch、天平山淫羊藿EpimediummyrianthumSteam、毡毛淫羊藿EpimediumcoactumH.R.Liang et W.M.Yan及黔岭淫羊藿EpimediumleptorrhizumStearn的干燥地上部分。凭证标本存放于国药集团同济堂(贵州)制药有限公司。样品来源见表1。
表1 样品来源
2.1 显微鉴别
将叶片用水浸泡后擦干，分别撕取上表皮及下表皮，制片，透化，置显微镜下进行观察。粗毛淫羊藿叶：表面观，上、下表皮细胞垂周壁深波状弯曲。下表皮气孔众多，圆形或类圆形，不定式。非腺毛多见，粗短，先端钝圆，多数顶端细胞极长，基部细胞较短。沿叶脉有异细胞纵向排列，内含多个草酸钙柱晶，形成明显的晶鞘纤维。天平山淫羊藿非腺毛多见，细长，先端较尖。毡毛淫羊藿非腺毛密集交错，柔软，弯曲，基部细胞较小。黔岭淫羊藿非腺毛少见。见图1。
注：A.上表皮细胞；
B.下表皮细胞；
C.气孔；
D.草酸钙柱晶；
E.粗毛淫羊藿非腺毛；
F.天平山淫羊藿非腺毛；
G.毡毛淫羊藿非腺毛。
2.2 薄层鉴别
取黔淫羊藿粉末(过3号筛)1 g，加石油醚(60 ℃～90 ℃)20 mL，加热回流30 min，滤过，弃去滤液，滤渣加乙醇25 mL，超声提取30 min(功率600 W，频率40 kHz)，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL使其溶解，用水饱和的正丁醇萃取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使其溶解，作为供试品溶液[15]。另取淫羊藿苷对照品、朝藿定C对照品，分别加甲醇制成1 mg·mL-1溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法(TLC)实验操作[16]，分别吸取对照品溶液和供试品溶液2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(8∶1∶0.5)为展开剂，预饱和20 min，展开，取出，晾干，喷以100 g·L-1的三氯化铝乙醇试液，105 ℃下加热3～6 min，置于紫外光灯365 nm处检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。结果见图2。
注：1、2.粗毛淫羊藿；
3、4.毡毛淫羊藿；
5、6.天平山淫羊藿；
7、8.黔岭淫羊藿；
9.淫羊藿苷、朝藿定C对照品；
10.淫羊藿苷对照品。
2.3 水分、总灰分和浸出物
按《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2020年版[16]，分别测定黔淫羊藿中的水分、总灰分和浸出物的含量(%)。12批样品水分平均值为9.50%，以平均值的120%设限则为11.40%，故建议将水分标准定为不得大于12%；
总灰分平均值为6.42%，以平均值的120%设限则为7.70%，故建议将总灰分标准定为不得大于8%；
浸出物平均值为18.72%，以平均值的80%设限则为14.98%，故建议将浸出标准定为不得少于15%。结果见表2。
表2 黔淫羊藿水分、灰分和浸出物测定结果
2.4 淫羊藿苷和朝藿定C含量测定
2.4.1供试品溶液的制备 取本品粉末(过3号筛)约0.2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 Hz)1 h，放冷，再称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，取上清液，滤过，取续滤液，作为供试品溶液[17-18]。
2.4.2混合对照品溶液的制备 取朝藿定C对照品及淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇，制成分别含朝藿定C 0.20 mg·mL-1、淫羊藿苷0.02 mg·mL-1的混合溶液，作为对照品溶液。
2.4.3空白对照溶液的制备 取稀乙醇作为阴性样品溶液。
2.4.4色谱条件与系统适用性实验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
以乙腈-水(30∶70)为流动相；
检测波长为270 nm；
流速为1 mL·min-1；
柱温为25 ℃；
进样量为10 μL；
理论板数按朝藿定C峰计算应不低于6 000。
2.4.5专属性 分别取2.4.1、2.4.2、2.4.3项下对照品溶液、供试品溶液、空白对照溶液各10 μL，按2.4.4项下色谱条件进行测定，结果表明，阴性样品无干扰，见图3[19]。
注：A.混合对照品溶液；
B.供试品溶液；
C.阴性对照溶液；
1.朝藿定C；
2.淫羊藿苷。
用二级管阵列检测器对供试品溶液中的淫羊藿苷和朝藿定C色谱峰进行峰光谱扫描和质量分数检测，结果峰质量分数角度<峰质量分数阈值，供试品中淫羊藿苷和朝藿定C光谱图与谱库中淫羊藿苷和朝藿定C光谱图匹配理想，说明淫羊藿苷和朝藿定C峰为纯峰，专属性强，符合要求。
2.4.6线性关系考察 精密吸取2.4.2项下朝藿定C、淫羊藿苷对照品0.5、1、2、5、7、10 mL，分别置于10 mL的量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取10 μL注入液相色谱仪，按2.4.4项下色谱条件，测定各自峰面积。以对照品的质量浓度(μg·mL-1)为横坐标，以峰面积为纵坐标，得标准曲线，求得朝藿定C的回归方程：y=31.619x+0.037 4，r2=0.999 9，线性范围为10.27～205.38 μg·mL-1；
求得淫羊藿苷的回归方程：y=37.535x+0.0245，r2=0.999 9，线性范围为2.50～49.95 μg·mL-1。结果表明，朝藿定C质量浓度在10.27～205.38 μg·mL-1范围内与峰面积值呈良好的线性关系；
淫羊藿苷质量浓度在2.50～49.95 μg·mL-1范围内与峰面积值呈良好的线性关系；
可用外标一点法计算含量。
2.4.7精密度实验 精密吸取朝藿定C、淫羊藿苷对照品混合溶液(朝藿定C 0.2 mg·mL-1，淫羊藿苷20 μg·mL-1)10 μL，按2.4.4项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果显示，朝藿定C、淫羊藿苷峰面积之和的RSD值为0.12%(n=6)，表明仪器的精密度良好。
2.4.8重复性实验 取黔淫羊藿(批号20170501)粉末(过3号筛)，混匀，取6 份，每份约0.2 g，精密称定，按2.4.3供试品溶液制备方法及色谱条件测定。朝藿定C、淫羊藿苷峰面积之和的RSD≤3.0%，表明该方法的重复性良好。
2.4.9稳定性实验 取2.4.8重复性实验制备的供试品溶液，按2.4.4项下色谱条件，分别于0、4、8、12、16、24 h测定淫羊藿苷和朝藿定C的总峰面积[19]。结果表明，朝藿定C及淫羊藿苷之和的RSD 为0.89%，表明朝藿定C及淫羊藿苷在24 h内基本稳定。
2.4.10色谱柱考察 取黔淫羊藿(批号20170501)，用5种品牌的色谱柱测定淫羊藿苷和朝藿定C的含量。色谱柱：太玮科技JADE-PAK ODS-AQ(250 mm×4.6 mm，5 μm)，安捷伦 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，菲罗门Superlu C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，依利特HypersilBDS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，迪马Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。结果显示，2个色谱峰分离良好，含量测定结果无显著差异，朝藿定C、淫羊藿苷峰面积之和的RSD值为2.3%，表明测定方法的耐用性较好。
2.4.11加样回收实验 取已知含量的黔淫羊藿(批号20170501)，混匀，取6份，每份约0.1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，每份分别加混合对照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，按2.4.1项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，按2.4.4项下色谱条件测定，计算朝藿定C和淫羊藿苷回收率，见表3、表4。朝藿定C平均回收率为101.62%，RSD为0.22%；
淫羊藿苷的平均回收率为93.72%，RSD为0.21%；
表明方法的准确度较好。
表3 朝藿定C加样回收率实验结果
表4 淫羊藿苷加样回收率实验结果
2.4.12样品含量测定 取粗毛淫羊藿溶液、毡毛淫羊藿溶液、天平山淫羊藿溶液、黔岭淫羊藿各3批，按2.4.1项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按2.4.4项下色谱条件进行测定，结果见表5。
表5 黔淫羊藿中朝藿定C与淫羊藿苷含量之和测定结果
根据测定结果，考虑到各种药材原料含量的波动，建议暂定粗毛淫羊藿含朝藿定C(C39H50O15)与淫羊藿苷(C33H40O15)含量之和不得少于0.2%；
毡毛淫羊藿和天平山淫羊藿含朝藿定C(C39H50O15)与淫羊藿苷(C33H40O15)含量之和不得少于1.0%；
黔岭淫羊藿中朝藿定C(C39H50O15)与淫羊藿苷(C33H40O15)含量之和的平均值为0.05%，因含量过低，故对黔岭淫羊藿中朝藿定C(C39H50O15)与淫羊藿苷(C33H40O15)暂不收入标准正文。
3.1 TLC供试品溶液制备
根据化学成分的溶解性，分别对以下条件进行考察：提取溶剂(石油醚、甲醇、乙醇)，提取方法(超声、回流)，提取溶剂用量(15、25、35 mL)，正丁醇萃取次数(1、2次)。结果表明，按本文2.3项下制备的供试品溶液鉴别斑点最清晰[20]。
3.2 薄层色谱条件考察
根据展开样品主要化学成分的极性，对以下条件进行了考察：展开系统如：水饱和的正丁醇，石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(4∶2)，甲苯-乙酸乙酯-甲酸(1.5∶4∶0.7)，正己烷-乙酸乙酯-甲酸(3∶1∶0.15)，乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1.3∶1)，三氯甲烷-甲醇-水-甲酸(6.5∶3.5∶1.5∶0.5)；
硅胶板种类(硅胶G板、硅胶H板，硅胶GF254板)；
点样量(3、5、10、15 μL)；
条带点样宽度(5、6、7、8 mm)；
薄层板预平衡时间(10、20、30 min)；
展开温度(10、20、30 ℃)[20]。结果表明，按2.2项下色谱条件，供试品与对照品及对照药材在不同的检视条件下色谱条带数较多，展开效果较好，分离度较好。
3.3 高效液相色谱法(HPLC)供试品溶液制备
分别对以下条件进行考察：提取溶剂(甲醇、不同浓度乙醇)，提取方法(超声、回流)，提取溶剂用量(30、50、70 mL)，提取时间(0.5、1.0、1.5 h)。结果表明，按2.4.1项下方法制备的供试品溶液峰面积最大[20]。
3.4 HPLC色谱条件选择
分别考察以乙腈-水(25∶75)。乙腈-水(30∶70)和乙腈-水(35∶65)为流动相时的分离情况，结果表明，以乙腈-水(30∶70)为流动相，各色谱峰的分离效果较好。用二极管陈列检测器对供试品溶液中淫羊藿苷和朝藿定C在210～400 nm波长范围内进行全波长扫描，结果表明，淫羊藿苷在波长为270 nm处的峰质量分数较高，峰面积最大，由此确定检测波长为270 nm。
本研究对黔淫羊藿进行了显微鉴别，对水分、总灰分、浸出物进行测定，改进了薄层色谱鉴别方法，改用高效液相色谱法测定黔淫羊藿中淫羊藿苷和朝藿定C含量，该方法专属性较强，稳定性、重复性、耐用性较好，准确度较高，为黔淫羊藿的质量控制标准的提高提供科学依据。
猜你喜欢 淫羊藿苷项下 不同基原淫羊藿补肾壮阳相关药效学比较研究江西中医药(2022年8期)2022-08-22淫羊藿“寒”“温”药性古今差异的文献考证环球中医药(2021年3期)2021-04-07货贸项下外汇业务中国外汇(2019年10期)2019-08-27服贸项下外汇业务中国外汇(2019年10期)2019-08-27UCP600项下电子签字剖析中国外汇(2019年22期)2019-05-21信用证项下的退单争议中国外汇(2019年21期)2019-05-21新型双相酶水解体系制备宝藿苷I中成药(2018年12期)2018-12-29淫羊藿临床中药师注意事项中国中医药现代远程教育(2018年22期)2018-02-09双藿苷A分子印迹聚合物的制备及应用中成药(2017年4期)2017-05-17淫羊藿药材质量影响因素研究进展中国药业(2015年4期)2015-03-02