皮肤鳞状细胞癌的肿瘤干细胞研究进展
孙忠辉， 张国龙， 王秀丽
（1.上海市奉贤区皮肤病防治所，上海 201408；
2. 同济大学医学院光医学研究所/上海市皮肤病医院，上海 200443）
皮肤鳞状细胞癌（Cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）属最常见的皮肤恶性肿瘤之一，好发年龄50～60岁，可发生于体表的任何部位，常在癌前病变光线性角化病的基础上发生。cSCC起源于表皮或毛囊附属器角质形成细胞。众多恶性肿瘤中存在肿瘤干细胞（Cancer stem cells，CSCs），已被得到证实。恶性肿瘤的进展、转移、耐药和复发，CSCs对其都有影响，当前针对 CSCs的靶向治疗已成为一种有前途的恶性肿瘤干预策略。用于cSCC靶向治疗的临床药物还不多，对CSCs的研究有助于这些药物的开发。cSCC肿瘤干细胞与表皮干细胞（Epidermal stem cells，ESCs）有一定的相似性，发现两者的差异性标记物，从而进一步明确两者信号通路的差别，可以为开发靶向药物奠定基础。本文综述目前cSCC中肿瘤干细胞的起源、特性和其标记物的研究进展。
干细胞能在一定条件下无限自我更新与分化增殖，产生表型与基因型和其同样的子代细胞，其具有多向分化潜能。目前证实在皮肤中干细胞有表皮干细胞、黑色素干细胞、真皮间充质多能干细胞、内皮干细胞和造血干细胞等5 种成体干细胞。这些细胞可产生相应细胞谱系，最终发育并形成完整的皮肤。ESCs又称上皮干细胞，是一种成体组织干细胞，包括毛囊间表皮（Interfollicular epidermis，IFE）、皮脂腺基底（Base of the sebaceous gland，BSG）和毛囊膨突部（Bulge of hair follicles，文献习惯用毛囊干细胞HFs简写）干细胞，它们具有祖细胞作用，有自我更新能力和高度增殖能力。毛囊膨突部细胞是多能干细胞，通常其产生毛囊，但在皮肤损伤时可分化再生为表皮和皮脂腺细胞［1］。
肿瘤组织内很大部分是只有增殖能力的肿瘤细胞，而肿瘤干细胞虽然仅一小部分，但能形成新的肿瘤克隆。它是慢细胞周期和永生化的起源驱动细胞，具有自我更新和分化能力。恶性肿瘤的转移和复发往往是由于CSCs没有被完全消灭［2］。肿瘤细胞通常是正常细胞经历4 ～7 次突变后形成。占表皮大多数的角质形成细胞如持续暴露在紫外线（Ultraviolet，UV ）、化学致癌物和人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）感染等环境中，获得致癌突变的能力会增高。在表皮，大多数获得突变的细胞都是在正常分化过程的终末中出现，而肿瘤的发展通常需要不止一次突变，因而皮肤肿瘤的发生相对较少。CSCs和正常干细胞具有部分相似的生物学特性。皮肤表皮中的CSCs来源于表皮干细胞（Epidermal stem cells，ESCs）［1］，ESCs也需要经历突变才能成为CSCs。ESCs具有形成肿瘤的能力，但是在致突变后克隆扩增的驱动因素出现前，它们尽管可能携带这些突变却在表型上一直是正常的。相较正常表皮干细胞，此阶段的ESCs及其子代具有明显异质性，它们具有更长的细胞周期，更强的修复能力，但是显然它们的癌变趋势明显增强［3］。
现有研究［4］证实，cSCC的起源细胞为表皮干细胞。二甲苯蒽（DMBA）/ 十四烷醋酸佛波醇（TPA）是一种常用的致cSCC的物质。研究［5］发现在DMBA治疗1年后给予TPA的小鼠与在DMBA治疗后立即暴露于TPA的小鼠相似，都会发生癌症；
无论何时给予TPA，肿瘤潜伏期都非常短。该研究表明cSCC中DMBA诱导的肿瘤干细胞是长寿命、慢循环的细胞，cSCC起源于表皮干细胞（ESCs），也就是毛囊间表皮干细胞（IFE）和毛囊膨突部细胞（HFs），因此cSCC中的CSCs也被认为起源于ESCs。然而仅获得干细胞特征还不足以导致这些ESCs恶性转化，研究表明特定类型或部位的细胞发生突变更为重要［5］。例如，HFs干细胞中如出现Harvey-Ras（H-Ras）表达通常具有高恶变能力，但当这种突变在IFE表皮干细胞中出现时，病变很少是恶性的，只有良性肿瘤生长（乳头状瘤形式）。这表明IFE起源的恶性肿瘤生长与其他促进因素的持续影响有关，而与H-Ras是否激活无关。cSCC长期以来被认为只是起源于HFs，但目前研究证明CSCs也可以来自IFE。维持完整的HFs 表皮干细胞，同时去除IFE 表皮干细胞，形成良性瘤和cSCC的能力都会降低。HFs突变成cSCC的能力降低表明cSCC起源细胞不仅来自HFs，也存在于IFE中［1］。
CSCs的可塑性（Plasticity）是指其具有转变为多种不同类型细胞的能力，而异质性（Heterogeneity）是指其子代与亲代及不同子代之间，表型或基因型方面的差异性。由于大多数恶性肿瘤含有以上特征的CSCs，因而这些肿瘤的发生、发展、转移和复发机制非常复杂，同时也造成了治疗的难度。
正常干细胞（SCs）定植在专门的微环境中，即所谓的壁龛（Niche）。外部信号可以调节干细胞状态及其后代的生物特性。在cSCC，皮肤由于长期暴露于紫外线、化学物或者HPV感染，在特定的调节信号表达或癌基因的激活参与下，SCs可转化为CSCs［6］。这种可塑性变化与微环境中上皮间质转化（EMT）密切相关。例如，毛囊膨突部干细胞（HFs）可以在Kras G12D表达和肿瘤抑制因子Tp53功能丧失时充当cSCC的起源肿瘤细胞。而环氧合酶-2（Cox-2）可以调节上皮间充质转变，能介导间充质样梭形细胞cSCC（预后较差的cSCC，鳞状细胞分化特征基本丧失）的形成。学者研究［7］利用工具鼠krt 15-crePR+ 在HFs中使癌基因Ras/Tp53相应表达诱导产生具有间充质特征的cSCC形成，然后下调并抑制Cox-2的功能，结果显示HFs来源的肿瘤间充质转化特征明显减少，而且肿瘤逐渐转化为具有上皮特征，向良性转化。
间充质细胞表型的获得使恶性肿瘤细胞容易侵袭和转移。EMT激活的过程涉及到一定的细胞因子和信号分子［8］。目前认为，转化生长因子β（TGF-β）是最重要的因子之一。cSCC侵袭进展过程中，CSCs能与肿瘤微环境相互作用。TGF-β上调引起CSCs释放IL-33作为信号，促进微环境募集ST2+造血祖细胞分化为FcεRIα+的巨噬细胞。FcεRIα+巨噬细胞又会释放TGF-β，由此产生富含TGF-β的微环境，激活TGF-β信号，进一步释放CSCs相关功能，如NRF2介导的抗氧化反应［9］，促进cSCC发展。
肿瘤都存在异质性，CSCs导致cSCC中的异质性与所涉及的特定癌基因有关。过渡扩充细胞（Transit-amplifying cell，TACs）是一种中间体，其介于干细胞和完全分化细胞之间。正常情况下，具有谱系限制性的TACs子代缺乏产生肿瘤，甚至良性乳头状瘤的能力。HFs中，对KrasG12D突变的反应是角质形成细胞过度增殖和去分化（乳头状瘤形式）。有研究表明尽管上游信号通路MAPK和AKT-S6表达均增加，但携带KrasG12D的TACs细胞表型依然能保持正常［10］。TACs细胞无异常表型可能是由于突变癌基因表达不足，从而未能启动肿瘤发生。另一项研究中，同样携带krasG12D 的HFs，在缺乏肿瘤抑制基因TP53的保护下，可发生cSCC。而且TP53如出现R172H突变和基因拷贝数改变会预后更差［11］。这些结果表明，特定癌基因或抑癌基因的激活和抑制决定了肿瘤的发生，并且可以出现在祖细胞、终末分化干细胞或低分化的TACs细胞中。因此，临床cSCC中肿瘤的不同分化状态可能与CSCs被特定基因如何激活有关。
原发的表皮肿瘤都起源于CSCs，然而特定基因突变的发生在不同情况下又可产生不同的肿瘤表型。角蛋白15（K15）是毛囊膨突干细胞的标志物。利用其 K15+小鼠模型，Kras的G12D突变可引发良性乳头状瘤，但再在DMBA诱导下可引发cSCC［12］。KrasG12D突变合并Smad4缺失不仅可以导致该模型鼠的转移性cSCC，而且还产生其他肿瘤，如基底细胞癌、毛发上皮瘤和皮脂腺瘤［13］。基底细胞癌和cSCC的CSCs都起源于表皮IFE和HFs，它们不同表型的引起显然与某些特定基因差异表达有关。近期有研究［14］表明基底细胞癌特异性基因（如GLI2、PTCH1/ 2、FZD7），在基底细胞癌细胞中高表达，但在cSCC中却下调。显然以上基因的表达在cSCC是抑癌因素，在基底细胞癌细胞中则是促癌因素。
目前，皮肤干细胞标记物包括CD34、CD44、ABC家族成员、CDl33、整合素、P63、CD20、角蛋白15、角蛋白17和角蛋白19等。cSCC中皮肤CSCs与皮肤干细胞有一定的相似性，以上标记物部分已被证实与皮肤鳞癌有关，比如CDl33［15］。但两者之间有何明确的区别目前还不清楚，需要进一步研究发现两者的差异性标记。明确两者信号通路的差异，选择性杀伤皮肤肿瘤干细胞，避免损伤皮肤干细胞，对肿瘤的治疗尤为重要［16］。
近期，在研究cSCC时发现肿瘤干细胞中一些与分类和发病有关的标志物，这些标志物备受人们的关注。①CD133 ：
cSCC肿瘤干细胞的表面标记物中最早可以作为分类标志。Patel等［15］研究癌症起始细胞（CIC）向皮肤肿瘤干细胞（CSC）转化时，首先采用基于CD133是否表达的cSCC细胞系简单分类，证明在异种移植模型中CD133阳性的CICs中含有异质性cSCC，而CD133阴性细胞不能维持cSCC继续发展［18］。除了细胞表面标记物，cSCC肿瘤干细胞还可以根据醛脱氢酶（ALDH）和ABC转运蛋白活性进行分类。②Survivin：
Lotti等［17］最早提出表皮干细胞是皮肤肿瘤起源细胞。他们研究了皮肤干细胞的标志物Survivin在cSCC展中的作用。siRNA敲除Survivin后减少了细胞克隆形成和细胞存活率，侵袭性降低。正常角质形成细胞转染致癌RAS逆转录 Q病毒和加入NF-κB抑制剂IκBαM可促进Survivin的表达。但是这些细胞中敲除Survivin虽然可以减少增殖，但不能阻止异种移植模型中肿瘤的形成，只会延缓它们的发展。③SOX2 ：
Siegle等［18］比较了小鼠cSCC的癌症起始细胞（Cancer initiating cells，CIC）、HFs干细胞和表皮祖细胞中的基因表达谱，发现它们表达最显著的是SOX2。通过免疫染色，证实SOX2在正常皮肤样本中缺失，只在cSCC中存在。SOX2在肿瘤/间质交界处的未分化细胞中表达，这些细胞来源于CSC微环境。SOX2基因敲除显示肿瘤生长减少，表明SOX2在cSCC的发展中起促癌作用。研究还显示SOX2从AK到cSCC谱系发展中表达均增加。④FRMD4A：有学者在鉴定IFE表皮干细胞时，发现FRMD4A是一个新的肿瘤干细胞标志物［19］。通过Q-PCR对cSCC细胞上的14个表皮干细胞标记物进行检测，证实FRMD4A是唯一一个在cSCC中持续上调明显的基因［20］。它的表达为探索正常干细胞和肿瘤干细胞标记物之间的关系提供了一种手段。FRMD4A可调节细胞间粘附并维持正常细胞中E-钙粘蛋白（E-cad）的表达；
在体外和体内的异种移植模型中，人cSCC细胞系中FRMD4A的敲除降低了肿瘤细胞的克隆形成效率和生长潜力。从机制上讲，FRMD4A的表达降低调节了Hippo通路，该通路与组织生长和癌症发展控制有关［21］。⑤Lrig1：
它是IFE表皮内的干细胞标志物和EGFR的拮抗剂。在cSCC中，Lrig1阳性干细胞群中炎症可以引起癌变。炎症因子IL-17R能够动员Lrig1阳性的干细胞增多从而影响伤口愈合和肿瘤发生。IL-17R可以影响EGFR通路，Lrig1能够起到肿瘤抑制因子作用［22］。⑥Lgr5是Wnt靶基因，肠上皮和毛囊的干细胞标记物。在小鼠模型可发现在毛囊干细胞“壁龛”中的慢循环细胞中表达。移植和谱系追踪实验表明，这些lgr5阳性细胞在很长一段时间内保持了毛囊的所有标志物，并可以构建整个新的毛囊。最近，已有研究表明Lgr5在cSCC中表达上调，可作为肿瘤干细胞标记物［23］。
以上是目前明确的皮肤干细胞标志物，也是肿瘤干细胞的标志物。它们的阳性表达可以区分出肿瘤干细胞。但它们并不精确，例如，CD133阳性细胞并不都是肿瘤干细胞，在非干细胞/祖细胞和非癌细胞中也可以检测到ALDH活性增加。
另外，调控皮肤 cSCC 中肿瘤干细胞生长的因子还有① TGF-β可以促进cSCC化疗耐药；
② BMI1：与肿瘤自我更新和肿瘤发生有关；
③ YAP1是Hippo 通路的关键下游效应器，影响正常表皮和 cSCC 中干细胞的生长；
④ Grhl3是保守的发育转录因子，与表皮分化、屏障形成有关，cSCC的发生起至关重要作用；
⑤ TARC（CCL17）驱动Grhl3 缺失模型中肿瘤细胞过度增殖；
⑥ miR-204 的缺失在晒伤中驱动 STAT3 促炎反应导致 cSCC 的发展；
⑦ MEK1过度表达会促进过度增殖和皮肤炎症，导致乳头状瘤形成［24］。
cSCC具有侵袭性并可向远处转移，晚期、转移性和免疫低下的患者非常适合生物治疗（包括靶向和生物治疗）。目前，在临床开展成熟的主要药物有EGFR抑制剂和免疫检查点抑制剂，远不能满足精准治疗的需求。几乎所有恶性肿瘤都存在CSCs，其存在往往导致肿瘤易侵袭、易复发和治疗抵抗。因此针对肿瘤干细胞治疗将更加具有目的性，更加精准，临床患者也将获益更大。肿瘤干细胞的治疗策略主要有靶向CSCs标志物、调节因子及相关异常信号通路［2］，靶抗原的特异性是成功根除CSCs和防止肿瘤复发的关键。尽管上文提到了多个在cSCC的CSCs标志物，但由于cSCC是一种高突变负担的肿瘤，就目前来说，以上所及并不是非常特异。但是，随着研究的深入，相信未来会必将出现特异、敏感的cSCC的CSCs标志物或调节因子，随之也产生相应的药物去治愈cSCC。
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