PI3K/Akt/mTOR,通路与足细胞自噬在糖尿病肾病肾功能修复中的研究
陈 婷，刘金彦
（1.济宁医学院临床医学院，山东 济宁 272067；
2.济宁市第一人民医院肾内科，山东 济宁 272011）
随着肥胖、久坐以及高糖（hyperglycemia，HG）、高脂（hyperlipemia，HLP）等不良饮食习惯的改变及遗传因素的影响，糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者群体不断扩大[1，2]。DM 及其并发症糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）的出现显著增加了全身多脏器功能障碍以及衰竭的风险[3，4]。在营养物质代谢紊乱的环境下，PI3K/Akt/mTOR 为轴的信号通路可显著激活自噬，促使足细胞为自身输送能量，延长寿命，减少蛋白尿的流失[5]。本文对PI3K/Akt/mTOR信号通路下多种调节因子激活足细胞自噬的相关生化途径进行综述，为寻找未来治疗的潜在靶点提供参考。
DKD 是DM 最为严重的并发症之一，是终末期肾病的源头所在，是进入肾脏替代治疗的主要原因[6，7]。DM 病程、血糖控制情况、基础疾病和遗传因素是DKD 的驱动因素[8]。1 型和2 型糖尿病患者发生DKD 风险及病理生理机制基本相似，均需要10～20 年才能表现出来。近些年来，DM 及DKD 患病人数不断扩大，长期HG 损害肾脏、心血管系统、神经、骨骼、眼等多个器官[9-11]。根据2020 年KDIGO 指南所述，DKD 的界定标准为尿蛋白排泄率持续升高≥30 mg/g，尿蛋白与尿肌酐的比值≥3 mg/mmol，或肾小球滤过率eGFR＜60 ml/（min·1.73 m2），或两者兼有，持续3 个月以上[12]。近年来，DKD 患者出现了一种非蛋白尿CKD 表型，其特征是eGFR 逐渐降低，无蛋白尿的出现[13，14]。有研究[15，16]通过建立DKD发展为肾衰竭的预测模型，探究影响DKD 预后的因素，结果显示较低的eGFR 与血红蛋白含量、高胱抑素C 水平、中性粒细胞与淋巴细胞比率和24 h 尿蛋白显著增加了DKD 患者接受肾脏替代治疗的风险。此外，肥胖、高血压、高尿酸与同型半胱氨酸血症、HG、HLP 等代谢综合征（metabolic syndrome，MS）可加速肾脏超微结构发生改变[17-19]。
由内皮细胞和足细胞产生的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）异常周转与修饰所致的肾小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）增厚是DKD 的早期病理改变；
损伤的内皮细胞表面产生促凝、促血管收缩因子以及抗血管生成因子，粘附分子、血管生成因子及其受体减少，内皮祖细胞减少，内皮细胞大量凋亡与血管平滑肌细胞增殖引起进行性肾微血管性缺血，上述多种病理改变通常被认为是DKD 中足细胞激活的早期信号[20，21]。若上述过程未能给予早期干预，将发生不可逆转的肾损害。Balmer LA 等[22]仅在HG 数天观察到肾小管肥大，小管间质改变，随着DKD 的进展，肾小管发生萎缩，小管间质纤维化改变，管周毛细血管稀疏。长期在HG 环境下，缺血缺氧促使足细胞发生代偿性肥大，ECM 产生过多，系膜基质中的蛋白质发生非酶糖基化导致系膜基质扩张，肾小球毛细血管袢被粉红色透明物质包围形成肾小球内微动脉瘤，又称Kimmelstiel Wilson（KW）结节，肾脏功能逐渐退化[17]。
肾小球滤过屏障是最复杂的生物膜，允许水分子通过，中小分子不能完全通过，白蛋白和大分子营养物质完全不能通过。足细胞是通过足突锚定在GBM 的外层的终末分化上皮细胞，参与构成滤过屏障，是减少蛋白尿产生的关键环节，一旦损伤，不可再生[23]。生理情况下，足细胞作为胰岛素敏感细胞，可通过细胞膜表面的葡萄糖转运体（glucose transporter，GLUTs）将葡萄糖转移至细胞内。DKD 患者体内存在着广泛的胰岛素抵抗，HG 使GLUTs 数量难以代偿性增加，葡萄糖向胞外转运率降低，如多元醇通路通量、晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）大量蓄积、AGEs 受体及其活化配体表达升高、细胞内信号转导递质PKC 亚型的刺激和氨基己糖信号通路激活使得细胞内葡萄糖水平持续升高[24]。HG 与HLP 引起活性氧、糖化蛋白和氧化脂质等多种有害生化因子大量产生可直接激活补体系统，启动促炎信号传导[25，26]。血管内皮细胞对氧化应激的易感性增加，肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）激活、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、TGF-β/SMAD 通路等多种机制诱导促炎因子释放[25]。线粒体稳态难以维持，细胞器的工作信号相互串扰，传入与传出小动脉玻璃样变，肾小球血流动力学改变导致灌注不足，自我调节功能受损，肾小球微循环受阻，系膜基质、小管间质中的胶原蛋白、纤维连接蛋白等细胞外基质蛋白沉积，致使营养素信号传递及摄取中断，能量代谢的平衡状态被严重打破，足细胞发生凋亡[26，27]。Matsusaka T 等[28]通过体外试验对足细胞损伤特点进行挖掘，结果显示毒素蓄积导致的足细胞损伤，损伤的足细胞可释放转化生长因子、内皮素-1、趋化因子等多种有毒物质波及周围的细胞，肾单位大量丢失。
自噬是细胞对氧化应激、炎症反应、营养缺乏等恶劣条件下作出的应激反应，分为巨噬、伴侣蛋白介导的自噬与微自噬三种模式，包括自噬诱导与自噬小体的形成等多个过程[29，30]。自噬程序的启动可将胞内衰老受损的细胞器以及异常的大分子物质、病原体转入溶酶体内降解，降解产物可作为能源物质被回收利用。这种自我清洁与能量循环的过程有利于节约外界能量供给，促进细胞生长发育，提高细胞生存适应性，保持细胞活力[31-33]。自噬周转的相对速率反映自噬活性的高低，又被称为自噬通量[34]。
mTOR 是自噬重要的调节因子，是一种丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶，共分为两种：mTOR 复合物1（mTORC1）和复合物2（mTORC2）[35]。mTORC1 是一种对RAPA 敏感的蛋白激酶复合物，由mTOR 调控相关蛋白（RAPTOR）、G 蛋白β-亚基样蛋白（Gβl）等多种成分组成，通过感知葡萄糖、氨基酸、氧的水平，磷酸化p70、S6K1、4EBP1 等多种调节因子参与细胞周期与自噬进程，维持营养物质平衡[32]。mTORC2 对RAPA 的敏感性远低于mTORC1，由mTOR、Gβ、对mTOR 的RAPA 不敏感的伴侣蛋白RICTOR 等成分组成，对生长因子敏感，负责细胞骨架的搭建[36]。
自噬程序的启动受多种信号通路的调控，高度进化保守的自噬相关基因（autophagy-related gene，ATG）的表达决定了自噬通量的大小与底物降解的高度选择性[37]。Audzeyenka I 等[36]通过实验发现，长期暴露于HG 环境下，由于细胞对胰岛素的敏感性被抑制，大鼠原代足细胞自噬相关基因Atg12-Atg5 表达减少，LC3-II、Beclin1 等自噬相关蛋白表达大幅度降低，自噬通量下调。mTORC1 抑制剂雷帕霉素（RAPA）是防止器官移植后临床排斥反应的常用药物，可特异性结合mTOR 激酶，抑制mTOR 活性[38，39]。Li Q 等[40]研究表明，AGEs 的积累抑制了足细胞对纤维连接蛋白的粘附与迁移，降低足细胞活力，提升凋亡水平。RAPA 的应用减少了HG 对足细胞的不利影响，而mTORC1 和mTORC2双抑制剂KU0063794 的应用进一步增加了HG 环境足细胞存活的可能性。Fang L 等[41]使用自噬增强剂低剂量RAP（1 ng/ml）恢复自噬，双免疫荧光染色显示足细胞素表达减少，分布模式得到明显改善，缺陷性自噬得以修复，滤过屏障功能受损得到缓解，因此恢复自噬活性可能是缓解足细胞损伤的新靶点。Yu S 等[42]也得出同样的结论。
生理状态下，足细胞膜表面镶嵌着大量生长因子受体与营养物质转运通道蛋白。当机体血糖水平升高时，胰岛素的分泌促进葡萄糖向细胞内转运，推进氨基酸、脂质等营养素的生物合成，抑制糖异生，足细胞内外环境处于稳定状态，以PI3K/Akt/mTOR通路为主轴的自噬机制往往不被激活而处于休眠状态[43，44]。在DKD 患者体内，在足细胞长期处于HG、HLP 环境时，使抗氧化能力大大受限[48]，活性氧的诱导与内质网应激信号的表达、胰岛素抵抗、营养物质代谢紊乱、毒素蓄积及激素的异常分泌、HG、HLP 刺激胰岛素样生长因子1（IGF-1）、胰高血糖素、一氧化氮（NO）、血管内皮生长因子（VEGF）和前列腺素等血管活性介质的释放[21]。DKD 前期肾小球内部灌注不足，足细胞长期处于饥饿状态，极易发生程序性死亡[40]。此时，能量感知因子与生长因子激活脑Ras同源蛋白（Rheb）开关，并与G 蛋白偶联受体（GPCRs）、酪氨酸激酶受体（TKRs）结合，触发磷脂酰肌醇激酶（PI3K）、PI3K 下游的蛋白激酶B（Akt）的磷酸化，进而激活mTORC1 的组成成分4EBP1 与S6K1 诱导自噬[46]，胞内有益成分的继续保留，异常免疫复合物及衰老损伤的细胞器及大分子物质降解，部分排出体外，部分合成核酸及其前体、蛋白质、脂质、ATP 和NADPH 等能源物质平衡细胞合成代谢与分解代谢[47]。mTORC2 位于Akt 的下游，磷酸化的Akt 启动mTORC2 参与细胞骨架的搭建，与此同时，mTORC1 也得到了最大程度的激活，mTORC1 与mTORC2 二者相辅相成，共同减少胰岛素抵抗诱导的细胞毒作用，实现细胞内营养物质的循环使用，细胞外源源不断的能量供应与足细胞的自我修复[43]。
有研究显示[48]，用正常培养液和无氨基酸培养液对足细胞进行体外培养，Western blot 检测到LC3Ⅱ和beclin1 水平增加，逆转录-定量聚合酶链反应结果显示LC3Ⅱ对应的mRNA 水平呈现上升趋势，透射电镜观察自噬小体大量产生，由此可知：氨基酸饥饿（amino acid starvation，AAS）可促进核转位，提高转录因子EB（TFEB）的活性，高活性的TFEB 可抑制mTOR，促进自噬体、自噬溶酶体的形成和底物降解。糖原合成酶激酶3β（GSK3β）作为糖原代谢的重要组成部分，已被证实为PI3K/Akt 通路的下游靶点，其活性与自噬呈负相关。
前期研究发现，肝细胞生长因子（HGF）通过抑制GSK3βHG 还原Ser9 磷酸化而增加自噬通量，因此Ser9 磷酸化是GSK3β 活化的指标。Hou B 等[49]评估HGF 在DKD 中足细胞稳态中的作用并进一步阐明其机制：对自噬相关蛋白和足细胞骨架蛋白--突触素（Synapt）进行免疫荧光双染色发现DKD 患者足细胞自噬通量受损。与未接受HGF 治疗的DM 小鼠相比，接受HGF 治疗的DM 小鼠的尿白蛋白排泄率、足细胞损失量显著降低，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例增加。HGF 的这些有益作用可被其抑制剂克唑替尼或PI3K 抑制剂LY294002 阻断，与对照组相比，DKD小鼠组p-Akt（ser473）/Akt 和pGSK3β（ser9）/GSK3β比值降低。上述实验证实HGF 在足细胞中通过PI3K/Akt-GSK3β-TFEB 轴改善溶酶体功能和自噬。表皮生长因子（EGF）已被认为是慢性肾脏疾病进展的潜在生物标志物，是典型的表皮生长因子受体（EGFR）配体，主要来源于肾脏。Sun Y 等[50]使用EGF 处理HG 刺激后的足细胞，DNA 甲基化表达谱分析显示，与HG 组相比，HG+EGF 组有9309 个CpG 高甲基化位点（5220 个基因）和3111 个CpG低甲基化位点（2511 个基因），差异甲基化基因在PI3K/AKT/mTOR 信号通路中显著富集，提示EGF介导的保护作用通过PI3K/AKT/mTOR 信号通路中的相关DNA 甲基化参与肾足细胞的修复。
当HG 诱导的脂质蓄积超过细胞的代偿能力时，对足细胞产生不可逆转的损伤[51]。既往研究表明[52-54]，硫氧还蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）参与调节细胞的糖、脂代谢。Du C等[55]研究了TXNIP 对DKD 中脂质积累的影响，与DM 野生型小鼠相比，敲除TXNIP 相关基因后，乙酰辅酶a 羧化酶、肉碱棕榈酰转移酶Ⅰ等脂代谢相关酶以及Akt、mTOR 的表达减弱，小鼠体内脂质积聚增加。使用PI3K 特异性抑制剂LY294002 阻断Akt/mTOR 信号通路，可以复制TXNIP 沉默的效果。因此，TXNIP 的存在可通过抑制Akt/mTOR 通路抑制自噬，加重脂质在肾脏中积聚。抑制TXNIP 的产生与释放可能为足细胞损伤相关肾病患者提供新的希望。HG 可诱导足细胞中精子相关抗原5（SPAG5）的mRNA 和相应蛋白表达上调，沉默SPAG5 可逆转HG 处理的足细胞凋亡小体与自噬小体减少的状况[56-58]。Xu J 等[59]发现SPAG5-as1 作为SPAG5 的邻居基因，与泛素特异性肽酶14（USP14）相互作用，使SPAG5 蛋白去泛素化并趋于稳定状态。因此，当SPAG5-as1 作用于SPAG5/AKT/mTOR 通路时，对足细胞自噬具有抑制作用，加剧足细胞凋亡。靶向调节SPAG5-as1/SPAG5 激活自噬为缓解足细胞损伤提供一种新的治疗选择。
含SH2 结构域的肌醇5"-磷酸酶（SHIP）被称为PI3K/Akt 通路的负调控因子[60]。Li F 等[61]研究发现，在DKD 小鼠体内，HG 以时间依赖性的方式降低了SHIP 的表达，同时激活了PI3K/Akt 信号通路导致ECM 的产生，而转染M90-SHIP 载体可以显著阻止这一过程；
在DM 小鼠体内腹腔注射SHIP 表达载体促使SHIP 高表达后发现，Akt 与结缔组织生长因子（CTGF）的表达明显降低，肾小管细胞的ECM 积累减少。可见，过表达SHIP 可能是一种通过失活PI3K/Akt 通路和抑制DKD 中CTGF 的产生来减少ECM 积聚的有效方法[62-64]。
自噬广泛存在于足细胞内，感知细胞内外能量变化并激活相应通路作出应答。生理情况下，PI3K/AKT/mTOR 通路往往不被激活；
在DKD 初期，细胞处于饥饿环境下并具有一定的代偿能力，以PI3K/AKT/mTOR 通路为轴，HGF、EGF、GSK3β-TFEB 等多种调节因子共同参与自噬，线粒体的生化反应以及细胞的大分子营养物质的生物合成得以顺利进行。然而，在DKD 终末期，MS 是其常见的并发症，TXNIP、SPAG5-AS1 等相关因子产生增多，SHIP 含量降低，抑制自噬，加速足细胞凋亡。上述多项研究结果多基于体外试验，为推进靶向治疗的进一步发展，今后还应加大药物研发力度，提高药物疗效。