地膜覆盖对旱作春玉米农田土壤微生物碳源代谢的影响
刘美霞,刘 秀,赵 燕,董雯怡,*,刘恩科
1 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所,北京 100081
2 农业农村部农膜污染防控重点实验室,北京 100081
3 河南科技大学园艺与植物保护学院,洛阳 471002
水资源短缺是限制世界许多国家粮食生产的一个重要因素，在全世界1400万km2耕地中，位于干旱半干旱的耕地有600万km2，占42.9%，我国干旱半干旱地区面积占全国总耕地面积的52.5%[1—2]。黄土高原是典型的干旱半干旱地区,也是我国旱作农业最重要的区域之一,由于气温低、降水少、可用水资源有限和土壤肥力低等原因,极大地限制了该地区的农业生产发展[3—5]。地膜覆盖由于具有良好的保温、保水等效果而在我国北方广泛应用[6]。前人研究结果表明地膜覆盖能够显著降低土壤水分蒸发,从而起到保水保墒的作用[7—8]。Zhao等[9]在地膜覆盖对旱作农田马铃薯水分利用效率和块茎产量的研究中发现,全覆盖处理的土壤水分利用效率最高,比对照提高了56.8%—70.3%；
马铃薯产量比对照高57.4%—78.2%。张万文等[10]在研究地膜覆盖对春玉米增产试验中发现,覆膜处理下的玉米的产量比裸地提高2940 kg/hm2,增产率达48%。由此可见,地膜覆盖在提高了我国干旱半干旱地区粮食产量、保障我国粮食安全方面起到重要作用。
土壤微生物是土壤生态系统中重要的组成部分,在维持生态系统物质转化、养分循环以及能量流动过程中发挥着关键作用[11]。土壤微生物碳源代谢特征反映了土壤微生物生态功能,常被作为评价土壤质量的重要指标[12—13]。然而环境因素(生物因素和非生物因素)和人为措施都会直接或间接地影响到土壤微生物代谢活性,而地膜覆盖由于改变了土壤微环境(水分和温度等),进而会对土壤微生物代谢活性造成一定的影响,因此研究地膜覆盖下的土壤微生物碳源代谢特征对衡量土壤质量具有重要的意义。Biolog-ECO微孔板能定量分析描述微生物对不同碳源的代谢多样性,被证明是研究微生物群落碳源代谢多样性的一种简单快速的方法,近20年来被广泛应用[14]。贾鹏丽等[15]运用Biolog生态板在研究东北黑土区不同土地利用方式(种植玉米、水稻、大豆及土豆)对土壤微生物碳源代谢多样性的研究发现,不同土地利用方式显著影响了土壤微生物群落碳源代谢多样性,并且碳水类、氨基酸类和羧酸类碳源为黑土微生物代谢的主要碳源类型,其中以碳水类尤为突出。近年来,关于土壤微生物对碳源利用多样性的研究主要集中在不同施肥处理、不同土壤类型以及不同作物影响效应对比研究中。通过对不同的土壤类型(黑土、褐土、潮土、红壤、灰漠土)[16—20]以及不同作物类型[21]进行研究表明,不同的农艺措施均可引起土壤微生物对六大类碳源利用能力以及微生物多样性的变化,但不同的地区其变化程度甚至是变化趋势有所不同[22]。
目前,对地膜覆盖的研究主要集中对于在土壤温度、水分、养分变化以及作物产量的影响上[7]。黄土高原是典型的传统旱作农业区,春玉米是该地区主要粮食作物之一,然而对覆膜措施下旱作春玉米不同的生育期以及不同土层中土壤微生物碳源代谢特征的变化研究鲜有报道,而这是衡量地膜覆盖条件下旱作农田土壤肥力固持特征的基础。因此,本试验依托山西省东部晋中市寿阳县农业环境与作物高效用水科学观测试验站为研究平台,开展地膜覆盖措施对春玉米农田土壤微生物碳源代谢特征的研究,探讨作物的不同生育期及不同土壤层次土壤微生物碳源代谢多样性与环境因子之间的相互作用关系,以期为我国北方旱作春玉米农田生产以及土壤质量提升提供理论依据。
1.1 试验地概况
本研究在山西省东部晋中市寿阳县(37°44′52″N,113°12′11″E)农业环境与作物高效用水科学观测试验站进行,该地区属于晋东豫西典型旱作农业区,海拔1202 m,属于温带大陆性季风气候区,属于半湿润偏干旱气候类型,试验地地势平坦,无灌溉条件。该地区年平均温度7.4℃,无霜期140 d左右,日照时数为2858.3 h。近5年年均降水量为518.3 mm,年内分布不均匀,主要集中在6—9月,占全年降雨量的80%以上。2020年主要集中在7—8月份,其中7月份97.6 mm、8月份254.1 mm；
玉米生长的其他月份降雨量较少(图1)。
图1 2020年玉米生育期月降雨量
1.2 试验设计
定位试验开始于2015年,种植制度为一年一熟制,种植作物为春玉米。试验共设2个处理:地膜覆盖(FM)和裸地不覆膜(LD),每个处理3次重复,共6个小区,每个小区为48 m2(长8 m×宽6 m),采用完全随机区组设计。春玉米供试品种为“郑单958”,种植密度60000株/hm2,行距50 cm,株距33.3 cm。各处理的肥料用量一致,氮肥为尿素(含N 46.7%)240 kg/hm2、磷肥为过磷酸钙(含P2O516%)150 kg/hm2、钾肥为氯化钾(KCl 60%)75 kg/hm2。覆膜采用人工铺设,地膜为微白色普通PE农用地膜,厚度0.008 mm,宽度1.2 m。
1.3 样品采集与测定
1.3.1土壤微生物碳代谢功能多样性测定
应用Biolog生态平板(ECO Micro Plate)对土壤微生物碳源代谢能力进行分析[23]：在超净工作台上,称取新鲜土壤样品5 g,加入45 mL经灭菌处理后的0.85% NaCl溶液,用封口膜密封三角瓶瓶口,固定于水平摇床上,以250 r/min均匀震荡30 min,取出摇匀,静置10 min,然后依次稀释至10-2、10-3的悬浮液。最后用8孔道移液器向Biolog-ECO板的每个孔中加入150μL的10-3悬浮液。将接种好的Biolog-ECO微平板放入27℃生化恒温培养箱内培养,分别于0、24、48、96、120、144、168、192 h在微孔板自动读数装置读取590 nm波长下的数值吸光值。
Biolog-ECO平板测定的每孔的颜色变化率(Average well color development, AWCD),来表示微生物群落利用单一碳源能力即微生物整体活性,计算公式如下：
AWCD=∑ (Ci-R)/n
式中,Ci为碳源的每个孔的光密度值,R为对照孔的光密度值,n为碳源的数目。
本实验对培养了144 h的Biolog-ECO平板孔中的光密度值进行统计分析,用Shannon多样性指数(H)、优势度指数(D)和均匀度指数(E)表征土壤微生物群落碳源代谢多样性。计算方法：
多样性指数H：
H=-∑Pi× lnPi
优势度指数D：
均匀度指数E：
E=HlnS
式中,Pi为第i孔吸光值与空白对照孔吸光值之差和所有反应孔吸光值之差总和的比值,S是Biolog-ECO平板中有颜色孔的数量。
1.3.2土壤养分含量测定
1.4 数据处理
试验数据使用Excel 2019(Microsoftware 2019)整理,采用Sigmaplot 12.5作图, 采用Origin 2021软件进行Pearson相关分析及作图。利用SPSS 19.0软件进行单因素方差(One-Way ANOVA)分析和主成分分析,方差分析多重比较采用最小显著差异(LSD)法,在P<0.05水平下检验差异显著性。
2.1 不同处理对土壤理化性质的影响
表1 各处理对土壤理化性质的影响
2.2 不同处理对土壤微生物碳源利用强度及多样性的影响
不同处理土壤AWCD值变化见图2。随着培养时间的延长，土壤微生物AWCD值逐渐提高。培养的前24 h内各处理的AWCD值变化不显著,24—144 h土壤AWCD值迅速增长144 h后缓慢增长,直至趋于稳定。拔节期呈现0—10 cm > 10—20 cm > 20—30 cm的变化趋势,且在144 h时FM显著高于LD处理；
且在0—10 cm、10—20 cm呈现出显著性差异。灌浆期在0—10 cm、20—30 cm土层以及以及收获期10—20 cm、20—30 cm土层中FM处理土壤AWCD值大于LD处理，而灌浆期0—20 cm土层和收获期0—10 cm土层的变化情况恰好相反：呈现出LD处理大于FM处理的变化趋势。
图2 不同处理微生物平均颜色变化率
Biolog主成分分析法能显示土壤微生物群落在不同的处理下对各类碳源的反应情况,是反应土壤微生物群落结构特征的有效手段[26]。根据培养144 h的AWCD数据,对31种碳源利用情况进行主成分分析(图3)。在主成分分析中,样本之间距离越近,表明样本间微生物群落代谢功能差异越小[27]。本研究选取拔节期、灌浆期和收获期前两个主成分进行分析：主成分1(PC1)和主成分2(PC2)。其中方差贡献率分别为44.7%、15.7%、26.3%、23.0%、30.1%、20.3%,累计方差贡献率为60.4%、49.3%、50.4%,说明PC1、PC2是微生物群落碳源利用差异的主要来源,可以解释大部分的信息。图3显示,FM措施下不同处理土壤微生物碳源利用对PC1和PC2相关的碳源利用能力不同,各处理在PC轴上表现出明显的差异,表明FM显著改变了土壤微生物对碳源的利用能力。按照每个碳源在区分能力方面的贡献率大小进行排序,选取每个主成分的前十个碳源进行分析,结果表明碳水类碳源在0—10 cm、10—20 cm和20—30 cm土层中PC1的权重比较大,可以认为碳水类碳源是区分不同处理的主要碳源。此外,与PC2相关较大的碳源随土层深度增加依次为羧酸类、碳水类和氨基酸类碳源,它们是区分FM与LD处理的另一部分主要碳源类型。
图3 土壤微生物碳源利用的主成分分析(PCA)
初始载荷因子为各碳源与各主成分的相关系数, 载荷因子值越高, 表示该碳源对主成分的影响越大[28]。如表2所示拔节期对PC1影响较大的碳源有14种,其中碳水类的有6种(分别为β-甲基-D-葡萄糖苷、I-赤藻糖醇、D-甘露醇、D-纤维二糖、葡萄糖- 1-磷酸盐、D,L-a-甘油)；
羧酸类有2种(D-半乳糖醛酸、a-丁酮酸)；
氨基酸类有2种(L-天冬酰胺酸、L-苏氨酸)；
胺类1种(苯乙基胺)；
芳香类1种(2-羟苯甲酸)；
多聚物类2种(a-环式糊精、肝糖)。拔节期对PC2影响较大的碳源有4种,其中羧酸类有2种(D-半乳糖醛酸、D-葡萄胺酸)；
氨基酸类有1种(L-精氨酸)；
多聚物类1种(吐温40)。灌浆期对PC1影响较大的碳源有15种,其中碳水类的有6种(分别为β-甲基-D-葡萄糖苷、D-木糖/戊醛糖、D-甘露醇、N-乙酰基-D-葡萄胺、D-纤维二糖、D,L-a-甘油)；
羧酸类有2种(y-羟基丁酸、a-丁酮酸)；
氨基酸类有2种(L-天冬酰胺酸、L-苏氨酸)；
胺类1种(苯乙基胺)；
芳香类1种(Acid 2-羟苯甲酸)；
多聚物类3种(吐温40、a-环式糊精、肝糖)。灌浆期对PC2影响较大的碳源有6种,其中碳水类的有4种(分别为β-甲基-D-葡萄糖苷、D-木糖/戊醛糖、D-纤维二糖、葡萄糖- 1-磷酸盐)；
羧酸类有1种(D-葡萄胺酸)；
氨基酸类有1种(L-天冬酰胺酸)。收获期对PC1影响较大的碳源有8种,其中碳水类的有2种(分别为N-乙酰基-D-葡萄胺、葡萄糖- 1-磷酸盐)；
羧酸类有4种(丙酮酸甲酯、y-羟基丁酸、衣康酸、D-苹果酸)；
氨基酸类有1种(L-苯基丙氨酸)；
多聚物类1种(吐温80)。收获期对PC2影响较大的碳源有8种,其中碳水类的有4种(分别为I-赤藻糖醇、D-甘露醇、D-纤维二糖、D-半乳糖酸γ-内酯)；
羧酸类有1种(D-葡萄胺酸、)；
氨基酸类有3种(L-天冬酰胺酸、L-苯基丙氨酸、L-苏氨酸)；
多聚物类1种(吐温80)。
表2 不同处理在PC1与PC2上的荷载值
本研究中各处理土壤微生物对6大类碳源的利用率大小依次为：碳水类 > 羧酸类 > 氨基酸类 > 多聚物类 > 芳香类 > 胺类(图4)。各时期各土层不同处理下土壤微生物群落对同一类型的碳源的利用程度存在明显差异(P<0.05)。具体表现在：与LD相比,FM处理显著增加了拔节期0—10 cm、10—20 cm和20—30 cm、灌浆期0—10 cm和20—30 cm以及收获期10—20 cm和20—30 cm土层中土壤微生物对碳水类、羧酸类两大类碳源的利用率(P<0.05,图4)；
而FM和LD处理下土壤微生物对胺类、芳香类两大类碳源的利用率都比较低,且处理间未见显著性差异(P>0.05,图4)；
收获期0—10 cm土层中,土壤微生物对六大类碳源的利用率呈现出FM处理低于LD处理,且处理间差异显著(P<0.05,图4)。
图4 各处理对土壤微生物碳源代谢多样性的影响
为了进一步的确定FM对各时期不同土层土壤微生物碳源代谢多样性的影响状况,本研究计算了FM和LD处理Shannon多样性指数(H)、优势度指数(D)和均匀度指数(E)(表3)。结果表明,不同指数在两处理中差异显著(P<0.05)。具体来看,与LD相比,FM处理在拔节期10—20 cm、20—30 cm,灌浆期0—10 cm、20—30 cm以及收获期所有土层中的Shannon多样性指数(H)相对较低；
而拔节期0—10 cm,灌浆期10—20 cm土层中的Shannon多样性指数(H)相对较高。对于均匀度指数,FM处理下拔节期各个土层、灌浆期0—10 cm、20—30 cm以及收获期10—20 cm、20—30 cm土层中土壤微生物均匀度指数(E)相对较低；
而在灌浆期和收获期10—20 cm土层土壤微生物均匀度指数(E)相对较高。对于优势度指数(D)结果表明,在拔节期10—20 cm、20—30 cm,灌浆期不同土层以及收获期0—10 cm、20—30 cm土层均呈现出FM处理显著高于LD处理(表3)。
表3 土壤微生物群落多样性指数
2.3 土壤微生物碳源利用与环境影响因子相关关系
图5 土壤理化性质与土壤微生物群落碳源利用多样性之间的相关性分析
土壤微生物群落碳源代谢特征可以反映不同碳源代谢利用的差异,体现土壤微生物整体活性和微生物群落生态功能多样性[29]。本研究结果表明,地膜覆盖显著影响了土壤微生物对六大类碳源的代谢活性。覆膜处理的土壤微生物对碳源的利用程度总体上高于裸地不覆膜处理,并随土壤深度的增加而呈现出递减趋势(P<0.05)(图2),说明地膜覆盖对提高土壤微生物总体代谢活性尤其是表层土壤微生物代谢活性具有重要的作用[30]。相关研究认为,长期的地膜覆盖导致了土壤理化性质的差异是土壤微生物碳源代谢活性产生差异的主要决定因素[31],由于地膜覆盖很大程度上改善了土壤微环境,促进了植物根系生长和土壤养分循环转化,为土壤微生物的生长代谢提供了适宜的条件,进而提高了土壤微生物的代谢活性[31],但随着土壤深度的增加覆膜措施产生的作用逐渐减小,使得覆膜与裸地处理下土壤微生物碳源利用能力之间的差异逐渐缩小。
Shannon多样性指数(H)、优势度指数(D)和均匀度指数(E)常被用作表征土壤微生物多样性指数[17]。多样性指数是优势度和均匀度指数组合起来的一个指标,能够比较全面地反映出微生物的物种多样性；
D值是用来衡量群落组成水平最常用的指标之一,其数值的大小反映出群落受优势度物种影响的大小程度；
E值表示种群的物种优势度,其值越大,群落中物种越丰富[18]。我们发现长期进行地膜覆盖显著影响了土壤微生物碳源代谢的多样性指数。与LD相比,FM措施增加了土壤微生物的优势度指数(D)。这与Huang等[32]在黄土高原半干旱区进行不同覆盖措施对玉米农田土壤微生物群落影响试验中的研究结果基本一致。大量研究表明[31],土壤微生物多样性对土壤养分、pH、水分和温度等外界条件变化十分敏感,从表1中我们可以发现覆膜处理在各个生育期均能有效改善土壤理化性质,能够为土壤微生物创造一个相对稳定而又潮湿的土壤养分环境,促进了土壤微生物多样性的提升。然而,本研究中FM处理相比LD处理土壤微生物的均匀度指数(E)。侯晓杰等[33]在东北地区进行的不同施肥与地膜覆盖对玉米田土壤微生物功能多样性的研究中研究结论与此一致,他们指数由于地膜覆盖条件下长期施入无机肥料不利于土壤氮素的挥发,太多的氮素可能对微生物的活性起到极大的抑制作用,而某些土壤微生物抵抗外界干扰的能力较弱,从而降低了土壤微生物的均匀度。
在本研究中覆膜与裸地处理土壤微生物对六大类碳源的相对利用率均呈现出碳水类 > 羧酸类 > 氨基酸类 > 多聚物类 > 芳香类 > 胺类的趋势,主要集中于碳水类、羧酸类和氨基酸类三大类碳源,是土壤中最活跃的有机碳库[26],其中碳水类碳源约占土壤有机质总量的5%—25%,是土壤微生物生存的主要碳源[34],与土壤微生物活性显著相关,是土壤活性有机碳库的重要组分。覆膜措施对土壤微生物碳源利用能力的增加效果呈现出拔节期 > 灌浆期 > 收获期的变化趋势,地膜覆盖下拔节期、灌浆期的土壤微生物显著增强了对碳水类、羧酸类和多聚类三大类碳源的代谢能力(P<0.05),而收获期对各类碳源的代谢能力均呈现出显著降低趋势(P<0.05)。本研究中土壤微生物碳源利用状况与土壤SOC、TN含量呈显著或极显著的正相关关系。拔节期和灌浆期是土壤水热条件较好以及植物生长最旺盛的时期,作物生长带走了大量的土壤养分,而黄土高原地区土壤养分含量水平本身就很低,土壤有机物质分解作用的加强,直接导致收获期土壤养分含量降低[35],而土壤微生物和作物根系竞争有限的矿化养分,也不利于土壤微生物的后期生长[36]。10—20 cm土层中,与LD相比,FM处理下拔节期土壤微生物对各类碳源的代谢能力均表现出显著增加趋势(P<0.05)；
灌浆期土壤微生物碳源利用差异主要为碳水类、羧酸类和氨基酸类三大类碳源；
而收获期主要表现在碳水类、羧酸类和多聚物类三大类碳源(图4)。这说明了10—20 cm土层中,土壤微生物代谢的主要碳源类型随着作物生育期不断地发生着变化。Yang等[37]在研究长期覆盖对苹果园土壤微生物碳代谢季节性影响的试验中发现,不同季节覆盖作物对土壤微生物碳源代谢能力的影响存在差异,作者解释到这与不同覆盖作物根系分泌物的差异以及根系生理活动的季节性差异息息相关。在20—30 cm土层,FM与LD处理在各时期土壤微生物碳源利用能力主要差异均表现在碳水类、羧酸类和氨基酸类三大类碳源的利用上(图4)。一方面说明FM虽然能显著提高土壤微生物对20—30 cm土壤微生物碳源的利用能力,但并未改变土壤微生物主要的碳源代谢类型；
另一方面说明碳水类、羧酸类和氨基酸类三大类碳源是土壤微生物碳源代谢的主要碳源,这与前人研究结果基本一致[18]。同时,本试验通过对培养144 h的碳源的AWCD值进行主成分因子荷载值分析,发现不同处理之间土壤微生物碳源代谢能力差异主要集中在碳水类4类、氨基酸类2类、羧酸类1类共7类碳源中(表2)。综合分析可知,覆膜措施有利于提高土壤微生物对碳源的利用能力,各处理间差异较大,且对碳水类、氨基酸类两大类碳源的利用能力最高。由图1我们还发现,作物生长的不同时期内(拔节期、灌浆期和收获期),FM措施对拔节期土壤微生物碳源利用的增加效果最为明显。各时期土壤微生物碳源代谢能力整体上呈现出0—10 cm > 10—20 cm > 20—30 cm的变化趋势,且FM措施下土壤微生物碳源利用能力基本上高于LD处理。一方面说明随着土层深度的增加微生物碳源利用能力显著降低,另一方面说明FM措施能显著改善土壤微环境,促进微生物碳源代谢活性。同时,0—10 cm和10—20 cm土层,表现为灌浆期土壤微生物碳源利用能力较高,而20—30 cm土层,表现为收获期碳源利用能力较高,差异均主要体现在碳水类、羧酸类、氨基酸类三大类碳源。进一步表明碳水类、羧酸类和氨基酸类三大类碳源是区分各处理主要的碳源类型[18]。
1)连续五年地膜覆盖措施显著提高了旱作春玉米农田土壤微生物碳源代谢活性及多样性指数，使土壤微生物对碳源的利用方式发生改变与LD相比，FM措施增加了土壤微生物的碳源优势度指数，而降低了土壤微生物碳源均匀度指数。
2)FM与LD处理土壤微生物对六大类碳源的相对利用率均呈现出碳水类 > 羧酸 > 氨基酸 > 多聚物 >胺类 > 酚酸的趋势；
且FM与LD处理土壤微生物碳源利用能力在各时期均随土层增加而降低。其中在0—10 cm和10—20 cm土层,各处理土壤微生物碳源利用情况均表现为灌浆期较高,而20—30 cm土层,表现为收获期碳源利用能力较高,且差异均主要体现在土壤微生物对碳水类、羧酸类、氨基酸类三大类碳源的利用上。
3)在0—10 cm土层中,拔节期和灌浆期FM处理的土壤微生物碳源利用能力显著高于LD处理；
然而收获期恰好相反,呈现出LD处理的土壤微生物碳源利用能力显著高于FM处理,初步推测覆膜措施增强了土壤微生物和作物对表层土壤养分的吸收,导致后期土壤养分与土壤微生物碳源利用效率降低。