保健食品中叶黄素总量的高效液相色谱分析测定

刘艳荣 原敏 蒲雅洁

（山西健硕食品药品研究院有限公司，山西太原 030006）

叶黄素是一种广泛存在于蔬菜、水果、花卉等植物中的类胡萝卜素，在自然界与玉米黄素同时存在，主要来源是万寿菊植物。叶黄素是一种优良的抗氧化剂，有保护视力、延缓动脉硬化、抗癌等功能，作为食品添加剂使用，和其他有益互补营养元素一起添加到食品中起保健作用。

根据文献报道，高效液相色谱法是测定叶黄素的主要方法，该方法准确、可靠、灵敏度高。由于叶黄素本身结构的不稳定性，常常是以叶黄素微囊粉或叶黄素酯的形式添加到保健食品中，因此不同的提取方法对叶黄素测定结果的影响非常大。本文采用含BHT 的乙醇溶液对样品中的叶黄素进行提取，在碱液中皂化转化为游离叶黄素，然后混合有机溶剂萃取，采用高效液相色谱外标法定量，同时对其方法学内容进行考查，试验结果良好。该方法既可以有效提取保健食品样品中的叶黄素，又可以准确定量。

1.1 仪器

LC-20AT 高效液相色谱仪，附紫外检测器，日本岛津仪器有限公司；
UV1800 紫外可见分光光度计，日本岛津仪器有限公司；
电子分析天平，日本岛津仪器有限公司；
振荡器，常州国华电器有限公司；
旋转蒸发仪，瑞士步琦有限公司；
低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.2 试剂与材料

叶黄素标准品，CAS:127-40-2，成都德斯特；
叶黄素保健食品，市售；
甲醇、乙腈、环己烷、乙醚、正己烷、无水乙醇，均为色谱纯；
二丁基羟基甲苯（BHT）。氢氧化钾，均为分析纯；
娃哈哈纯净水；
孔径0.45μm有机滤膜。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：C18色谱柱，5μm，250 mm×4.6 mm（内径）；
柱温：30 ℃；
流动相：甲醇∶乙腈∶水=10:9:1；
流速：1.0 mL/min；
检测波长：445 nm；
进样量：10μL。

1.3.2 标准溶液配制

准确称取5 mg（精确至0.01 mg）叶黄素，以0.1% BHT 乙醇溶液溶解并定容至100 mL，配成50μg/mL 的标准储备液。

1.3.3 标准储备液校正

取1 mL 标准储备液，以乙醇定容至25 mL。移取该溶液至1 cm 的石英比色皿中，以乙醇为空白，用分光光度计在波长445 nm处测定吸光度值。按下式计算标准溶液质量浓度：

式中：X—标准溶液质量浓度，μg/mL；

A—标准溶液的吸光度值；

E—乙醇中叶黄素的吸光系数，为2 550 dL/g；
25—稀释倍数；

10 000—转换系数（g/dL转化为μg/mL）。

1.3.4 样品处理

准确称取0.2 g 均匀试样于50 mL 聚丙烯离心管中，加入约0.2 gBHT 和10 mL 乙醇，混匀，加入10 mL10%氢氧化钾溶液，涡旋振荡1 min 混匀，室温避光振荡皂化30 min，加10 mL 萃取溶剂（其中环己烷∶乙醚∶正己烷=20∶40∶40，含0.1%BHT）避光涡旋振荡提取3 min，离心，重复提取2次，合并提取液，以10 mL 水洗涤，合并有机相于室温减压浓缩至近干，加0.1%BHT 乙醇溶液涡旋避光振荡溶解残渣并定容至10 mL，过孔径0.45μm 滤膜，供液相色谱测定。

2.1 色谱柱的选择

比较了C18和C302 种色谱柱的分离效果，结果表明，叶黄素都能很好的出峰。同等条件下，C30色谱柱由于碳链的长度与类胡萝卜素化合物分子的长度接近，二者的相互作用得到了增强，更适合各种复杂异构体的分离。因此，对于保健食品中叶黄素总量的检测，选择了应用更为广泛的C18色谱柱。

2.2 流动相的选择

在查阅参考文献的基础上，选择了甲醇-甲基叔丁基醚、乙腈-水、甲醇-乙腈-水共3 种流动相体系进行比较。结果发现，甲醇-甲基叔丁基醚体系色谱柱平衡时间长，在反相色谱中应用少；
乙腈-水体系中叶黄素出峰早，与样品中杂质难以分离；
甲醇-乙腈-水体系中能得到比较好的色谱峰。因此选择甲醇-乙腈-水作为流动相体系。

2.3 标准曲线的线性范围

从校正过的叶黄素标准储备液中准确移取2.0 mL、4.0 mL、8.0 mL、10.0 mL、15.0 mL、25.0 mL溶液分别到6 个25 mL 棕色容量瓶中，用0.1 %BHT 乙醇溶液定容至刻度。将得到的标准系列工作液分别注入液相色谱中，测定相应的峰面积，以叶黄素质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线（见图1），得到回归方程为y=95 571x-164 969，R为0.999 4，R2为0.998 7，结果表明在4μg/mL～50μg/mL 范围内线性良好。

2.4 精密度

精密吸取10μL 叶黄素标准溶液（16μg/mL），重复进样6 次测得叶黄素峰面积，结果如下页表1所示。由表1 可知，RSD为0.33 %，表明仪器精密度良好。

表1 叶黄素精密度试验结果

2.5 方法重复性

准确称取6 份均匀试样，按照1.3.4 的方式处理后进行样品含量的测定，结果如表2所示。由表2可知，测得样品中叶黄素平均含量为0.132 5 g/100g，RSD为1.67%。

表2 重复性试验结果

2.6 方法准确度

准确称取0.1 g 均匀样品（精确至0.01 g）置于50 mL聚丙烯离心管中，平行称取9份，按照1∶0.5、1∶1、1∶1.5 的比例分别加入校正后的标准溶液（50μg/mL）1.4 mL、2.8 mL、4.2 mL，每个比例3个平行。分别加入约0.2 gBHT 和10 mL 乙醇，混匀，后续操作过程同样品测定，回收率试验结果见表3。由表3 可知，回收率在102.10%～103.91%之间，表明该方法测定结果准确可靠。

表3 回收率试验结果

2.7 实际样品测定

选择另外2 种样品按照上述条件进行处理，每个样品测定2 次，取平均值，按照外标法定量，结果见表4。

表4 试样中叶黄素测定结果

本文建立的保健食品中叶黄素总量的测定方法，具有良好的线性、精密度、重复性和满意的回收率，具有灵敏度高，准确度高的优点。通过对市售实际样品的测定，结果均符合产品的标准要求，该方法可用于保健食品中叶黄素总量的分析测定。

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