连作对寒地双孢蘑菇土壤微生物的影响

付静,郑焕春,郭劲鹏

连作对寒地双孢蘑菇土壤微生物的影响

付静,郑焕春*,郭劲鹏

黑龙江省林业科学院牡丹江分院, 黑龙江 牡丹江 157010

为解决双孢蘑菇连作障碍，通过对其连续栽培土壤中的微生物不同生长年限和生长期进行采集、测定、分离研究。研究表明：连续种植双孢菇三年的土壤，细菌数量不同生长期先升高再降低，逐年上升；
放线菌数量不同生长期变化较平稳，但随着种植年限上升较大；
真菌数量不同生长期变化较小，逐年变化也不显著。从土样中分离的对双孢蘑菇菌丝生长起促进的作用的微生物7种，其中固氮菌 N1、芽孢杆菌C1和链霉菌A1对双孢蘑菇菌丝生长促进作用较大。

连作; 双孢蘑菇; 土壤微生物

土壤微生物是评价土壤质量的指标之一[1]。土壤中的微生物，包括细菌、放线菌、真菌具有较强的酶系统，可以分解土壤和培养基质中难以吸收的大分子有机物为小分子，为双孢蘑菇所利用。有些放线菌还能产生抗生素，成为双孢蘑菇栽培的“天然”杀菌剂，因此可以说土壤微生物是双孢蘑菇栽培中环境因素之一。

解决双孢蘑菇连作障碍，对其栽培土壤中的微生物研究是第一步，也是非常重要的组成部分，理清双孢蘑菇及其与环境微生物共同作用的关系对于解决双孢蘑菇连作障碍问题，实现棚室连续栽培的关键和重中之重[2,3]。

研究以双孢蘑菇连作土壤为主进行试验研究，以解决双孢蘑菇连作障碍为目的，对栽培地土壤微生物连续变化情况进行研究。

土壤微生物的三大主要类群包括细菌、放线菌和真菌[4]。它们构成了土壤微生物的主要生物微环境，任何一种数量和类别发生变化，都影响土壤的生物活性水平。调查对双孢蘑菇连作前后土壤中的微生物变化情况，将会使我们清楚地认识到双孢蘑菇及其与土壤微生物相互作用关系，连作后菌群变化对双孢蘑菇生长和产量的变化影响。这将指导我们在进行双孢蘑菇连作后如何进行土壤性能指标的调整，对双孢蘑菇等草腐菌类的棚室连作提供试验依据。

1.1 材料

1.1.1 供试土壤采自牡丹江市郊，种植双孢蘑菇连续三年的土壤为试验样品。

1.1.2 供试培养基按表1配制土壤微生物培养基。

1.2 方法

1.2.1 土壤样品采集设置不同采样点，每块处理面积为10 m×1.5 m，共15 m2。采用五点取样法，试验区土壤分成五个区，去除2 cm表面土后，各取0.5 kg土壤，土样混合均匀，装入无菌的自封塑料袋内，供微生物试验所用。

1.2.2 土壤样液制备土壤悬浮液：准确称取新鲜土壤样品10.000 g，置于250 mL的无菌锥形瓶内，加入90 mL无菌水，磁力搅拌器上120 rpm震荡25 min，制得土壤悬浮液。

土壤稀释液：按表2遵守无菌技术操作规程配制不同稀释度的土壤稀释液，供微生物测定使用。

表 2 不同稀释度的土壤稀释液配制

1.2.3 土壤微生物测定

（1）三种土壤微生物培养基各自配置好后，121 ℃灭菌20 min，冷却至45 ℃左右时制作平板，待平板冷却后测定土壤微生物。

（2）在牛肉膏蛋白胨培养基上加入稀释度10-7和10- 8的土壤稀释液各200 mL培养细菌，每稀释度5次重复，37 ℃培养2 d，以平板表面涂抹法计数，重复3次试验。

（3）在加入0.3%重铬酸钾溶液的高氏一号培养基上加入稀释度10-3和10-4的土壤稀释液各200 mL培养放线菌，每稀释度5次重复。28 ℃培养5 d，以平板表面涂抹法计数，重复3次试验。

（4）在链霉素PDA培养基上加入稀释度10-3和10-4的土壤稀释液各200 mL培养真菌，每稀释度重复5次。28 ℃培养5 d后，以平板表面涂抹法计数，重复3次试验。

每克土壤中菌落计算方法：菌落数=计数皿中平均菌落数×稀释倍数×5[5]

1.2.4 双孢蘑菇连作对土壤微生物的影响分别取不同生长年限不同土壤地块的采样点，对不同种植年限的双孢蘑菇分别进行细菌、真菌、放线菌数量变化趋势的测定。通过测试，判断双孢蘑菇连作对土壤中各微生物类群的影响。微生物取样方式、培养基及测定方法同前。

1.2.5 有益微生物的分离和鉴别分别从双孢蘑菇不同生长年限土壤地块中采样，制备系列稀释液，采用平板涂布分离法分离相关类别的微生物，并对双孢蘑菇菌丝体生长情况试验，判断连作土壤中有益微生物类群对双孢蘑菇菌丝的影响。微生物取样方式同前，分离培养基为：真菌使用马丁培养基，放线菌使用高氏一号培养基，细菌培养使用牛肉膏蛋白胨培养基。以色泽、菌落形态等培养特征为标准，挑取不同单个菌落分离纯化。并在综合PDA培养基中央接入双孢蘑菇菌丝，培养3 d后在双孢蘑菇菌丝体前端接入有益微生物纯化活菌体，混合培养于第3、6、9、12 d分别测量双孢蘑菇菌丝体直径，观察对比双孢蘑菇菌丝体生长特征变化[6-8]。

2.1 双孢蘑菇栽培地微生物数量情况

通过试验得到了双孢蘑菇栽培地微生物数量情况，结果如表3所示。在双孢蘑菇生长不同阶段：菌丝生长期、菇蕾期、出菇期、第二茬出菇期，土壤微生物中细菌的数量最多，达到108级别以上；
其次是放线菌，达到103级别以上；
真菌数量最少，处于103级别以下。可以看出种植双孢蘑菇的土壤细菌数量的变化大体上是呈现先升高再降低变化趋势，即双孢蘑菇菌丝生长到原基形成细菌数量逐渐增多，菇蕾期后逐渐降低时；
放线菌和真菌整体上是下降趋势，但分别在菇蕾期和出菇期有较多数量；
双孢蘑菇栽培地微生物数量不仅与双孢蘑菇不同生长期有关，也与温度、湿度变化情况关系密切。

表 3 双孢蘑菇不同生长期土壤微生物的数量/103cfu·g-1

土样中分离出的微生物经过镜下的分类和鉴定，经初步统计样地土壤涉及的微生物，包括杆菌、球菌、链霉菌等共有63种、放线菌有44种、细菌有36种。

2.2 双孢蘑菇连作地双孢蘑菇与土壤微生物的相互作用关系

针对不同生长年限和不同生长期种植双孢蘑菇的土壤进行微生物种群及其数量的动态研究，探索各生长年限和生长期的不同种类微生物种群及其数量变化趋势，发现土壤微生物与双孢蘑菇生长发育的变化规律，对于进一步探讨双孢蘑菇连作障碍控制技术都有着现实意义。

2.2.1 双孢蘑菇不同种植年限和生长期土壤细菌的变化趋势通过试验，双孢蘑菇不同种植年限不同生长期的土壤中细菌变化情况如下：

图 1 双孢蘑菇不同生长年限和生长期细菌的数量

由图1可以看出双孢蘑菇种植三年的土壤，细菌数量的总体变化趋势大致相同，都是波浪式变化，先升高再降低；
种植1年的双孢蘑菇土壤细菌的数量随着时间变化而增加，在原基形成期达到最大值，在出菇期回落；
而种植2～3年的双孢蘑菇均是在菇蕾期土壤细菌的数量达到最大，出菇期则略低于菇蕾期。同时，随着种植年限的增加，土壤细菌的数量差异明显，双孢蘑菇种植2年土壤中的细菌数量比种植当年有所增长，而种植3年的土壤比种植2年的细菌数量增长较多。

表 5 双孢蘑菇不同生长年限和生长期细菌数量的方差分析

注：A为年限；
B为生长期；
下同。

Note：A is years; B is growing period; the same below.

对不同生长年限和不同生长期种植的双孢蘑菇土壤中细菌数量进行方差分析（见表5），结果表明不同年限和不同生长期的细菌数量差异极显著。

有可能是双孢蘑菇菌丝体在土壤中的旺盛生长，为土壤中细菌的加速繁殖提供了更丰富的营养条件，而细菌数量的增加又反过来抑制了双孢蘑菇的菌丝体生长发育和菇蕾形成，造成双孢蘑菇连作减产。

2.2.2 双孢蘑菇不同种植年限和生长期土壤放线菌的变化趋势通过试验，双孢蘑菇不同种植年限不同生长期的土壤中放线菌变化情况见图2。

图 2 双孢蘑菇不同年限和生长期连作地放线菌的数量变化

由图2可以看出：随着不同的种植年限和生长期放线菌的数量变化情况，种植1年的双孢蘑菇土壤中随着生长期放线菌的数量呈先下降后增加的趋势，第2年和第3年双孢蘑菇种植土壤中放线菌的数量比种植当年的有所增长，在菇蕾期和出菇期双孢蘑菇种植2年和3年的土壤比种植1年的土壤中放线菌的数量增加较多。由此可见，放线菌数量在双孢蘑菇的出菇期间变化比较大，连作后，在形成双孢蘑菇菇蕾期间放线菌数量增长较大，有可能抑制了双孢蘑菇菇蕾的形成，进而影响了其产量。

表 6 双孢蘑菇不同生长年限和生长期放线菌数量的方差分析

对不同生长年限和不同生长期种植的双孢蘑菇土壤中放线菌数量进行方差分析（见表6），结果表明不同年限和不同生长期的放线菌数量差异极显著。

分析其原因，抗生素主要由放线菌产生，有可能其产生的抗生素大部分抑制双孢蘑菇的生长发育，同时，放线菌同双孢蘑菇一样，其生长所必须的主要营养元素也是碳素和氮素，都能广泛利用纤维素、半纤维素、木质素等含碳和蛋白质等含氮化合物，因此，导致双孢蘑菇连作障碍的原因也有可能是连作后放线菌数量的激增。

2.2.3 双孢蘑菇不同种植年限和生长期土壤真菌的变化趋势双孢蘑菇不同种植年限不同生长期土壤真菌的变化试验结果见图3。

图 3 双孢蘑菇不同年限和生长期连作地真菌的数量变化

从图3来看，双孢蘑菇种植当年、连作1年、2年时土壤真菌的数量在菇蕾期之前数量有一定差异，由于环境条件变化引起的土壤真菌数量别分在菌丝期、原基形成期、菇蕾期有一定小幅波动，但变化均较小，而当双孢蘑菇进入出菇期后，土壤中真菌数量增至最多。

表 7 双孢蘑菇不同生长年限和生长期真菌数量的方差分析

对不同生长年限和不同生长期种植的双孢蘑菇土壤中真菌数量进行方差分析（见表7），结果表明不同生长期的真菌数量差异极显著，而不同年限对真菌数量没有多大影响。

双孢蘑菇土壤真菌数量在种植当年、种植2年与种植3年的几个生长期内分别相比，数量并无特别大的变化。可能是因为双孢蘑菇就是真菌的缘故，土壤环境有利于双孢蘑菇生长的条件下时，也对其他真菌的生长起到促进作用，这可能是导致双孢蘑菇和土壤真菌数量较为同步的可能原因。而连续种植3年时，土壤真菌数量变化不显著。

2.3 连作地土壤有益微生物的分离和鉴别

相比较之下，相关资料中对双孢蘑菇连作对土壤微生物的影响方面的研究较多，但是对于连作土壤中对双孢蘑菇有益微生物种类的研究极少，试验就连作土壤中有益微生物对双孢蘑菇菌丝的生长进行了相关试验。

从土样中分离的对双孢蘑菇菌丝生长起促进的作用的微生物，根据菌落形态特征和数量组成共选留7种，其中固氮菌1种( N1），链霉菌2 种( A1、A2)，假单孢菌1种（B1），芽孢杆菌2种（C1、C2）、嗜热细菌2种（Y1、Y2）。对双孢蘑菇菌丝体生长影响情况见表8。

表 8 有益微生物对双孢蘑菇菌丝体生长影响

对双孢蘑菇菌丝体促进作用主要表现在两个方面：一是处理后短期的促进作用；
二是平稳的促进作用。从对双孢蘑菇菌丝生长有益的微生物种类看，而细菌作用强度最大，其中促进作用较大的是细菌中的固氮菌N1，其次是细菌中的芽孢杆菌C1和放线菌中的链霉菌A1。

（1）近年来寒地双孢蘑菇发展较快，生产过程中发现存在严重重茬的问题，连年种植的棚室病虫害日益严重，产量下降，效益降低，阻碍了寒地双孢蘑菇的发展，为了寒地双孢蘑菇可持续发展，研究其连续三年的连作土壤微生物变化情况，并分离鉴别出有益微生物，下步将对这些有益微生物对双孢蘑菇的产量和品质的影响情况进一步研究；

（2）相关资料中对双孢蘑菇连作对土壤微生物的影响方面的研究较多[9,10]。但是对于连作土壤中对双孢蘑菇有益微生物种类的研究极少，就连作土壤中有益微生物对双孢蘑菇菌丝的生长进行了相关试验。同时因为双孢蘑菇种植地域不同，其土壤微生物相差较大，寒地情况研究较少；

（3）经过试验发现连续种植双孢蘑菇三年的土壤，细菌数量不同生长期先升高再降低，逐年上升；
放线菌数量不同生长期变化较平稳，但随着种植年限上升较大；
真菌数量不同生长期变化较小，逐年变化也不显著。从土样中分离的对双孢蘑菇菌丝生长起促进的作用的微生物7种，其中固氮菌1种( N1），链霉菌2种( A1、A2)，假单孢菌1种（B1），芽孢杆菌2种（C1、C2）、嗜热细菌2种（Y1、Y2）。其中N1、C1和A1对双孢蘑菇菌丝生长起促进作用较大；

（4）细菌、真菌、放线菌这三大微生物类群都是土壤物质生物转化过程中的重要成员，在土壤肥力变化、动植物残体的降解等方面起着非常重要作用。通过试验可知，连作后双孢蘑菇的土壤环境中三大类微生物数量都发生了变化，其细菌和放线菌数量的变化差异较大，表明此时种植双孢蘑菇周边的土壤微生物平衡状态已被打破，土壤生态系统开始失调，可能会对双孢蘑菇的正常生长发育造成不良影响。试验只对双孢蘑菇连续种植三年的地块土壤进行了微生物试验，连作更多年限的的双孢蘑菇地块还需要进一步的验证，同时传统平板计数法的采用还具有一定的局限性，土壤中的微生物群落不是全部可以被人工培养出来，双孢蘑菇连作及其土壤微生物群落之间的互相影响规律还有待于进一步深入探索研究。

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The Effect of Successive Cropping on Soil Microbials ofin Cold Area

FU Jing, ZHENG Huan-chun*, GUO Jin-peng

157010,

In order to solve the obstacle of continuous cropping of, the microorganism in the soil of continuous cropping ofs was collected, measured and isolated in different replanting years and plant periods. The results showed that the quantity of soil microbial community was different with different replanting years and different growth periods. The quantity of bacteria increased first and then decreased in different plant period, and increased with the replant years. The quantity of actinomycetes changed steadily in different planting period, but increased greatly with the planting years. The quanty of fungi changed little in different plant periods and did not change significantly year by year. There were 7 kinds of microbes which could promote the growth ofmycelium, among which nitrogen fixing bacteria N1, bacillus C1and streptomyces A1could promote the growth ofmycelium.

Succesive cropping;; soil microorganism

S646

A

1000-2324(2022)03-0374-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.03.006

2022-03-14

2022-04-04

中央财政林业科技项目([2016]TQ005)

付静(1983-),女,硕士,工程师,研究方向为食用菌栽培技术、林木遗传育种. E-mail:55920867@qq.com

Author for correspondence. E-mail:zzhc2000@163.com

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