基于16S,rRNA高通量测序分析9种中药饮片污染微生物群落特征*
陈 柯，陈 敏，林 黎，邹惠亮
（湖州市食品药品检验研究院，浙江 湖州 313000）
中药饮片是一种特殊的药品类型，是指中药材经过适当的炮制后制成的可直接用于中医临床或制剂生产使用的一类药品。中药饮片来源多样，特别是植物和动物来源的饮片在加工炮制、运输和储存过程中容易受到微生物污染，从而影响中药饮片的药效和质量安全[1]。近年来，在国家药品监督管理局展开的质量抽检活动中多次发现中药饮片质量不合格，其中微生物污染是导致其合格率低的重要原因之一[2-3]。目前，《中华人民共和国药典》（2020年版）中对中药饮片微生物限度的检查方法沿用的仍然是传统的平板培养法，但这种方法的检出率较低，有研究[4]表明，平板培养只能获得不到1%的可培养微生物，这无法全面反映受污染的中药饮片的微生物的实际情况，而病原微生物的污染却有可能对人体带来极其严重的危害。因此，对中药饮片中的微生物群落特征进行鉴定具有重要意义。随着分子生物技术的飞速发展，高通量测序可以同时对海量的基因序列进行测定，具有高输出量和高解析度的优点[5]，可以在大大缩短时间的同时提供丰富的遗传学信息。本研究拟采用高通量测序对浙江省湖州市南太湖地区9种中药饮片（每个品种10个批次，共计90批）进行16S核糖体RNA（16S rRNA）测序，获得其污染微生物的菌落特征，了解中药饮片微生物污染的实际情况，以期为中药饮片微生物限度的控制提供依据。
1.1 主要仪器与试剂 Miseq核酸测序仪（美国Illumina公司）、QuantStudioTM 6 Flex实时定量PCR扩增仪（赛默飞世尔科技公司）、SH-2020A全自动琼脂凝胶糖电泳仪（北京金桑特医用仪器有限公司）、MiSeq DNA Flex制备试剂盒（美国Illumina公司）、SYBR Premix Ex Taq ⅡDNA聚合酶试剂盒（日本TAKARA公司）。
1.2 方法
1.2.1 中药饮片采集 柴胡、白术、山药、玄参、麦冬、焦栀子、砂仁、铁皮枫斗、金银花共计9种来源于南太湖地区的中药饮片品种，每个品种10个批次，共收集中药饮片样品90批。每批取100 g样品在无菌条件下进行粉碎，取粉末待测。
1.2.2 控制菌检查 根据《中华人民共和国药典》2020年版四部[6]中关于中药饮片微生物限度检查法的相关要求进行耐胆盐革兰氏阴性菌和沙门菌的检查。
（1）耐胆盐革兰氏阴性菌检查：取10 g待测样品，与TSB培养基以1∶10的比例进行混合，在20～25 ℃条件下培养2 h，取相当于供试品0.1 g的预培养物接种至肠道菌增菌液体培养基中，于35 ℃条件下培养48 h，然后于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上进行划线接种，接种后继续于35 ℃条件下培养24 h。
（2）沙门氏菌检查：取10 g待测样品，与TSB培养基以1:10的比例进行混合，在33 ℃条件下培养24 h，取0.1 mL培养物接种至10 mL RV沙门增菌液体培养基，继续33 ℃培养24 h，然后于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上进行划线接种，接种后继续于33 ℃条件下培养48 h。
（3）菌落鉴定：挑取上述平板培养基中不同形态的微生物菌落，再次划线接种于TSA平板培养基中，分离纯化后采用VITEK生化鉴定系统进行鉴定。
1.2.3 高通量测序 先采用DNA试剂盒抽提DNA，然后进行PCR扩增，引物设计如下：
上游引物：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’；
下游引物：926R5’-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3’。
扩增条件为：95 ℃预变性3 min，95℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，72 ℃保持7 min，共35个循环。分别对细菌16S rRNA的V4-V5区进行PCR扩增，扩增结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳，分别测定260 nm和280 nm下的吸光度值（OD值），并采用两者的比值评价DNA的纯度。然后采用凝胶回收试剂盒回收PCR阳性扩增产物，并以其为模板，进行二次PCR扩增，获得的PCR产物，采用Quanti FluorTM-ST蓝色荧光定量系统进行定量分析，然后按照测序要求进行混匀，采用MiSeq Reagent Kit v3（2×300 cycle）芯片进行测序。
1.2.4 多样性分析 测得的序列采用FLASH和Trimmomatic软件进行序列优化，获得有效序列，将最终优化后的序列与数据库中16S rRNA序列进行比对，并对上述序列进行操作分类单元（Operational Taxonomic Unit，OTU）分类，以97%的相似度聚类成同一个OUT，给予OUT序列进行α多样性（alpha diversity）分析，获得丰富度指数（Chaol指数）和多样性指数，多样性指数包括香农指数（Shannon index）和辛普森指数（Simpson index），在各分类水平上进行微生物群落特征分析。
2.1 控制菌检查结果 90批中药饮片中有1批山药检测出沙门菌和大肠埃希菌，有41批检出耐胆盐革兰氏阴性菌，各中药饮片的的耐胆盐革兰氏阴性菌检出率见表1。其中检出率最低的3种为焦栀子、麦冬和铁皮枫斗，检出率最高的3种为山药、金银花和白术，这3种饮片耐胆盐革兰氏阴性菌检出率明显高于其它中药饮片，差异均有统计学意义（P＜0.05），总检出率为45.56%。
表1 9 种中药饮片耐胆盐革兰阴性菌检出率
2.2 菌落鉴定结果 9种中药饮片中共鉴定出肠杆菌科、假单胞菌科、巴斯德氏菌科、莫拉菌科4个科的污染微生物，其中肠杆菌科检出比例最高。鉴定出的微生物包括肠杆菌属、泛菌属、假单胞菌属、克罗诺杆菌属、沙门氏菌属、埃希菌属、巴斯德氏菌属、克雷伯氏菌属、不动杆菌属、变形杆菌属共10个属。鉴定出的微生物包括产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、成团泛菌、赫氏埃希菌、铜绿假单胞菌、中间肠杆菌、阪崎克罗诺杆菌、沙门氏菌、大肠埃希菌、多杀巴斯德氏菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、产粘变形杆菌、奇异变形杆菌共15个种。（见表2）
表2 9 种中药饮片微生物鉴定结果
2.3 16S rRNA高通量测序结果 通过高通量测序获得上述9种中药饮片的有效序列，并对所有有效序列进行Tags聚类分析，并在97%的相似度下进一步进行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚类分析。其中柴胡、砂仁和山药获得最多有效序列，分别为33 691、33 284、33 169，铁皮枫斗获得最少的有效序列。所有样品经OTUs分析共计产生1 322个OTUs，其中前三位为柴胡、金银花、山药，其OTUs数量分别为184、173、162。（见表3）对上述样品在97%的相似度阈值下进行α多样性分析，共获得186种污染微生物，并获得各样品的丰富度指数（Chaol指数）和多样性指数（Shannon指数、Simpson指数）。（见表4）Chaol指数越大说明丰富度越高，Shannon指数、Simpson指数越大说明多样性越高。
表3 9 种中药饮片高通量测序序列统计
2.4 属水平微生物分布情况 在属水平对9种中药饮片中的污染微生物进行统计，相对丰富≥0.01的污染微生物共有32个属，优势均属为肠杆菌属、假单胞菌属、泛菌属、变形杆菌属、不动杆菌属、克罗诺杆菌属、克雷伯氏菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属。其中柴胡、玄参、铁皮枫斗的优势菌属为肠杆菌属，白术、山药、焦栀子、砂仁、金银花的优势菌属为泛菌属，麦冬的优势菌属为链球菌。（见图1）
图1 9 种中药饮片属水平微生物相对丰富分布情况
本研究选取的研究对象为9种常见的中药饮片[7]，控制菌检查结果发现耐胆盐革兰氏阴性菌检出率为45.56%，沙门菌和大肠埃希菌也被检出。沙门氏菌是诱发伤寒和急性肠胃炎的主要元凶，严重时可诱发败血症，危急生命安全[8]。大肠埃希菌正常情况下对人体无害，但某些类型的大肠埃希菌能通过产生内毒素来诱发腹泻[9]。本次结果还发现焦栀子、麦冬和铁皮枫斗这3种经过炒制或者加热烘干的饮片的检出率最低。范一灵等[10]对100批中药饮片进行需氧菌、霉菌、酵母菌及耐热菌检测，发现耐热菌检出率为61%，微生物风险残留较高。甘永琦等[11]对广西等地区9种中药饮片的微生物污染现状进行调查，发现茎类饮片耐胆盐革兰氏阴性菌和耐热菌污染率较高，而果实类饮片霉菌污染率较高。经鉴定9种中药饮片中共鉴定出4个科、10个属共15种污染微生物。其中除沙门氏菌外，还检测出了阴沟肠杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、奇异变形杆菌等重要的条件致病菌。微生物污染不仅有可能影响中药饮片的质量和疗效，还可能影响其安全性[12]。该结果提示中药饮片中的病原菌微生物污染不容忽视。
为了对中药饮片中的微生物污染情况进行全面分析，本研究进一步采用高通量测序，结果在柴胡、砂仁和山药获得最多有效序列，通常认为一个有效序列来自于一种菌，提示这3种中药饮片中的基因信息最多。再进一步进行OTUs聚类分析以获得各种中药饮片中微生物的种属信息，结果发现柴胡、白术和山药具有最高的Chaol指数，柴胡、山药和砂仁具有最高的Shannon指数，柴胡、山药和砂仁具有最高的Simpson指数。而麦冬、焦栀子和铁皮枫斗这3种饮片观察到的微生物种类，以及Chaol指数、Shannon指数和Simpson指数都相对最低，这可能是由于其炮制过程有经过炒制和加热有关，该结果与前文控制菌检查结果有相似之处。其中，Chaol指数越代表物种数量，Chaol指数越高，群落的丰富度越高；
Shannon指数是描述的是种的个体出现的紊乱和不确定性，Shannon指数越高，群落的多样性也就越高；
Simpson指数指数代表的是群落中种数个体分配的均匀程度，Simpson指数越高，群落多样性越好。这3种指数是通过不同的算法来反应微生物群落的丰富度和均匀度，指数越高，通常代表微生物群落的多样性越丰富[13-14]，以上结果提示柴胡、白术、山药和砂仁这4种中药饮片中的微生物多样性最为丰富，而麦冬、焦栀子和铁皮枫斗中的微生物多样性最少。
高通量测序共获得186种污染微生物，其数量远远高于控制菌检出的15种污染微生物，且各种饮片在属水平上具有很大差异，检出最多的属为肠杆菌属、假单胞菌属、泛菌属、变形杆菌属、不动杆菌属、克罗诺杆菌属、克雷伯氏菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属。甘永琦等[15]通过飞行时间质谱（TOF-MS）和高通量测序对多种中药饮片中的耐胆盐微生物群落进行分析，发现最主要的微生物为肠杆菌科和假单胞菌科，属水平上检出率最高为肠杆菌属和泛菌属，与本研究有相似之处。肠杆菌属包含阴沟肠杆菌等能诱发下呼吸道感染、软组织感染的病原菌，这类病原菌对消毒剂和抗生素具有强烈的抵抗力，具有较强的耐药性[16]。假单胞菌属的铜绿假单胞菌是继发性感染的主要条件致病菌，变形杆菌可导致腹膜炎、脑膜炎和败血症等，鲍曼不动杆菌可导致呼吸道感染、泌尿系统感染、继发性脑膜炎等多种感染性疾病，肺炎克雷伯氏菌可以导致肺炎和败血症[17]。以上微生物都是引起医院感染的重要病原菌。除了控制菌检出的污染微生物外，芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属等菌属仅在高通量测序中检出，且经相对丰度指数分析发现麦冬的优势菌属为链球菌。而这些菌属是主要的致病菌和条件致病菌所在属，金黄色葡萄球菌能引发食物中毒和多种化脓性炎症；
链球菌属包含肺炎链球菌等多种致病菌，能引起各种化脓性炎症、猩红热、败血症、脑膜等多种临床疾病；
肠球菌属对多种抗菌药具有固有耐药性，是仅次于葡萄球菌属的最重要的医院感染病原菌。
综上所述，中药饮片中存在微生物污染情况，并包含致病菌，具有一定的致病风险。高通量测序可以无需通过微生物培养即可获得中药饮片中的微生物群落特征信息，与传统平板培养相比较，更加快速和全面。
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